當田中耕一因發(fā)現(xiàn)‘生物大分子的軟電離技術’而獲得2002年諾貝爾化學獎時,他一定沒有預想到,短短十幾年時間,這一技術能夠在微生物領域帶來如此巨大的變革。

　　MALDI-TOF MS這一技術自應用于微生物以來，其技術的成熟度和商品化程度迅猛發(fā)展令人咂舌。今天當一位臨床微生物工作者說出“鑒定結果來自質譜”時，已經不再是帶有些許的懷疑，而是成竹在胸的自信。成本低廉、操作簡單、快速而準確已經使得質譜技術成為微生物發(fā)展中不可阻擋的一股趨勢。

　　即使在這樣的潮流下，也并非所有的事情都是那么一帆風順的。

　　比如對于微生物中的絲狀真菌，應用于質譜鑒定并非一路坦途。

　　不論是產品研發(fā)還是臨床應用，絲狀真菌在譜上的鑒定似乎注定要經歷更多的時間和坎坷，而當下微生物工作者在這個問題上似乎仍然更依賴于形態(tài)學鑒定，縱使遇到難題時首先也是考慮測序的方法。

關鍵問題一

　　從原理上來看，絲狀真菌的鑒定和細菌并無不同，此處省略1000字并再次腦補MALDI-TOF MS的原理過程……

　　然而必須要強調的是，對于微生物的質譜鑒定，一個足夠豐富、有組織性的數(shù)據(jù)庫才是真正重要的關鍵條件。這也是在某些數(shù)據(jù)庫中的一個顯著短板，即對于真菌，尤其是雙相真菌和絲狀真菌難以獲得一個令人滿意的結果，這些質譜系統(tǒng)要么是鑒定出一堆不相關的低分辨結果;要么由于分值太低而鑒定失敗。

　　需要注意!

　　對于鑒定失敗的情況，一方面可能是由于數(shù)據(jù)庫中確實不包含該菌種，另一方面可能數(shù)據(jù)庫中包含該菌種，但在臨床工作中分離出的臨床菌株因為和建庫菌株間的異質性(heterogeneity)而不能很好的匹配，導致沒有鑒定結果。

　　絲狀真菌質譜鑒定的復雜性正體現(xiàn)在此，由于絲狀真菌本身的蛋白成分相比細菌更加復雜，加之培養(yǎng)條件、菌絲體大小、產孢情況的不同，也會導致絲狀真菌的蛋白圖譜會發(fā)生較大的差異變化，這顯然給質譜的鑒定帶來了一定程度的挑戰(zhàn)。因為試圖通過少量菌株的圖譜來“演繹”所有菌株可能性的情況并不現(xiàn)實，這種蛋白表達上的“質”和“量”的變化是難以預測的。而可能的一個解決途徑則是盡可能收集不同來源的菌株和不同培養(yǎng)條件下獲得的圖譜，通過“歸納”的方法將所有蛋白特征進行整理，以期覆蓋該菌種的普遍性特征，并滿足臨床鑒定的需要。

黑曲霉在SDA平板上生長2天和8天獲取的圖譜

　　關鍵問題二

　　另一個問題是絲狀真菌的前處理：

　　和一般細菌以及酵母樣真菌不同，通過基質液甚至是甲酸處理并不能有效破壞其細胞壁并充分獲取其蛋白。這是因為絲狀真菌的細胞壁中包含一種叫幾丁質的物質，該物質同樣存在于昆蟲的甲殼中，它不能被普通的有機溶劑(乙醇、甲酸等)所溶解。這也是為什么很多實驗室按照一般的提取流程，所獲得用于分析的蛋白波峰非常少，從而導致鑒定失敗。

　　2018年10月，VITEK MS獲得FDA臨床實驗驗證的菌種數(shù)量已經達到401種，而其中絲狀真菌達到了47種；成為目前唯一通過FDA認證的可用于絲狀真菌的MALDI-TOF MS系統(tǒng)!

　　其中包括了毛霉、雙相真菌、皮膚真菌、暗色真菌、曲霉及其他潛在的病原菌。

　　在外部臨床實驗中總共檢測了1519株絲狀真菌，達到了91%的正確鑒定率2，這顯然已經完全達到了臨床診斷的要求。

　　值得注意!

　　VITEK MS IVD數(shù)據(jù)庫中的絲狀真菌已經超過了100種，但這其中仍然有一部分因為臨床試驗中沒有分離到足夠的菌株而尚未獲得FDA的認證。

　　VITEK MS通過FDA批準的絲狀真菌種類：

　　Q&A

　　為什么目前只有VITEK MS的絲狀真菌鑒定能夠通過FDA的嚴苛考評呢?

　　正如前文所述，一方面梅里埃為VITEK MS的數(shù)據(jù)庫開發(fā)提供了強大的菌株庫，作為擁有全球最大的菌株貯藏機構之一，在絲狀真菌的建庫上選擇了多株有代表性的菌株，同時經過不同的培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時間及不同的操作人員獲取圖譜并通過權重矩陣的算法實現(xiàn)對普遍性的覆蓋。

　　另一方面，專利性的絲狀真菌提取技術(U.S. Provisional Patent Application no. 62/209,116)能夠在保證生物安全的同時，實現(xiàn)高效率的蛋白提取，獲得高質量的蛋白圖譜。

　　2012年，VITEK MS成為史上第一臺獲得FDA認證的微生物質譜鑒定系統(tǒng)，從此質譜的臨床應用開啟了全新的時代。

　　而隨著絲狀真菌感染越來越受到臨床的關注，質譜鑒定的方法已經成為臨床工作中必不可少的選項，在這一領域中，VITEK MS再次走在了前列。

VITEK MS 全自動快速微生物質譜檢測系統(tǒng)