細菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌的細胞壁成分，當細菌死亡或自溶后便會釋放出內(nèi)毒素。其化學成分本質為磷脂多糖-蛋白質復合物，毒性成分主要為類脂質A。內(nèi)毒素小量入血后被肝臟枯否細胞滅活，不造成機體損害。大量進入人體循環(huán)系統(tǒng)后可引起發(fā)熱、微循環(huán)障礙、內(nèi)毒素休克及播散性血管內(nèi)凝血等反應——又叫“熱原反應”。因此，生物制劑、注射劑、抗生素類、疫苗類、透析液等制劑以及醫(yī)療器材類（如一次性注射器，植入性生物材料）必須經(jīng)過細菌內(nèi)毒素檢測試驗合格后才能使用。

化學藥品注射劑除內(nèi)毒素策略及超濾去除內(nèi)毒素的應用及優(yōu)勢。在化學藥品注射劑的制備過程中，難以避免的會從原輔料，過程，人員，設備和環(huán)境等環(huán)節(jié)中引入微生物及內(nèi)毒素。出于藥物安全的考量，藥典對于化學注射劑的內(nèi)毒素水平有嚴格的限定。這要求注射劑生產(chǎn)企業(yè)采取合理的策略，嚴格控制注射劑中的內(nèi)毒素含量。

 內(nèi)毒素特點

1.耐熱：100℃，加熱1小時，不會被破壞。只有在160℃，加熱2–4個小時，或用強堿、強酸或強氧化劑加溫煮沸30分鐘才能破壞它的生物活性。

2.抗原性弱：內(nèi)毒素不能被稀甲醛溶液脫去毒性成為類毒素；把內(nèi)毒素注射到機體內(nèi)雖可產(chǎn)生一定量的特異免疫產(chǎn)物（稱為抗體），中和作用較弱。

內(nèi)毒素的檢測

內(nèi)毒素的檢測常用家兔熱原法和鱟試驗法。由于家兔對“熱原”的反應與人基本相似，所以半個世紀以來用家兔來檢測熱原，為保障藥品質量和用藥安全發(fā)揮了重要作用。1956年美國人Bang發(fā)現(xiàn)美洲鱟血液遇革蘭氏陰性菌時會產(chǎn)生凝膠。其后Levin和Bang又搞清楚微量革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素也可以引起凝膠反應，從而創(chuàng)立了鱟試劑檢測法。由于鱟試劑法簡單﹑快速﹑靈敏﹑準確，已廣泛用于臨床、制藥工業(yè)藥品檢驗等方面。鱟的來源目前主要有2大區(qū)域，除了美洲還有亞洲的中國鱟。

(圖片來自網(wǎng)絡)

2005年版中國藥典規(guī)定168個品種進行細菌內(nèi)毒素檢查法。其中收錄的細菌內(nèi)毒素檢查法包括2種：凝膠法和光度法，都是使用鱟試劑檢測內(nèi)毒素。前者利用鱟試劑與細菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應的原理來定性檢測或半定量內(nèi)毒素，后者包括濁度法和顯色基質（比色）法，系分別利用鱟試劑與內(nèi)毒素反應過程中的濁度變化及產(chǎn)生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團的多少來定量測定內(nèi)毒素。比色法又可分為終點顯（比）色法和動態(tài)比色法。該方法靈敏度、精密度高。

鱟試驗收載于1980年20版美國藥典，又叫細菌內(nèi)毒素試驗（BET，Bacterial Endotoxin Test）；隨后英、德、意、日以及中國相繼在藥典中收載。此后鱟試驗逐漸替代家兔熱原試驗。但由于部分藥品自身特殊性無法通過稀釋法消除干擾，故鱟試驗無法完全取代家兔熱原試驗。

鱟試劑是鱟的血液變形細胞溶解物制成的無菌冷凍干燥品，含有絲氨酸蛋白酶原(C因子)、G因子。其中，C因子能被細菌內(nèi)毒素激活，G因子能被真菌葡聚糖激活，引起一系列酶促反應。根據(jù)鱟試劑反應原理，分別有針對細菌內(nèi)毒素和真菌葡聚糖兩種檢測試劑盒，用于細菌內(nèi)毒素含量和真菌感染的檢測(G試驗)。

原則解讀

該指導原則是對《1143細菌內(nèi)毒素檢查法》內(nèi)容和應用做進一步的說明。歸納起來有以下幾個重點：

1.詳細闡釋了內(nèi)毒素限值的設定依據(jù)：

內(nèi)毒素限值由公式“L = K/M”計算得到。其中M為“人用每千克體重每小時最大供試品劑量“，詳見《1143細菌內(nèi)毒素檢查法》對公式的解讀。K的取值考慮了不同劑型的特點。

指導原則中增加了“聯(lián)合用藥”“嬰幼兒”“營養(yǎng)不良”和“惡病質”等情況的用藥?？紤]到細菌內(nèi)毒素對體弱患者人群可能導致更嚴重的影響而更加嚴格的控制最大可接受量。100 mL及以上裝量的大輸液類制劑，其細菌內(nèi)毒素限值一般不得超過0.50 EU/mL。

 2.對于測量方法的選擇的考量：

對于這兩種檢查方法，可以根據(jù)需要進行選擇。凝膠法簡便易操作，有可能不能排除干擾作用；光度法可以定量，并且預測趨勢。凝膠法常用的反應容器為10 mm × 75 mm的玻璃小試管或空安瓿等，光度法常用的反應容器為測定儀專用試管或酶標板。

凝膠法：凝膠法的優(yōu)點是操作簡便，供試品在排除干擾作用后均可使用凝膠法進行檢驗。若樣品稀釋到MVD仍不能排除干擾作用，應進一步對供試品的前處理進行研究，再用干擾試驗驗證能否使用凝膠法。由于動態(tài)法的檢測限范圍比凝膠法寬，使得有干擾的樣品可以有更大的稀釋倍數(shù)，對于部分使用凝膠法無法排除干擾的樣品，可以嘗試使用動態(tài)法建立細菌內(nèi)毒素檢測方法。

光度法：包括濁度法和顯色法，可定量檢測內(nèi)毒素的含量。能較為準確評估產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中污染的相對風險，定量檢測的數(shù)據(jù)不僅有利于追蹤產(chǎn)品質量趨勢，還能起到風險預警的作用，更易達到數(shù)據(jù)完整性的要求。光度測定法可通過回收率判斷出干擾的趨勢，尤其對于研究性質的樣品(如新產(chǎn)品)更具有優(yōu)勢。

3.供試品的前處理技術：

*溶解樣品：內(nèi)毒素檢查用水

*助溶：超聲波、加熱、助溶劑、調(diào)節(jié)pH等

*有機溶劑（如乙醇、DMSO等）溶解時，必須進行干擾試驗

*包合技術（如微球、脂質體），采取適宜方法破壞，釋放內(nèi)毒素

4.檢查法的建立：

鱟試劑反應的一致性：應使用兩個生產(chǎn)廠家的鱟試劑對至少三批樣品進行干擾試驗。

不宜建立細菌內(nèi)毒素檢查項的情況：

*無法排除供試品對細菌內(nèi)毒素檢查的干擾作用

*只能使用最高靈敏度鱟試劑（凝膠法0.03 EU/mL，光度法0.001 EU/mL）排除干擾

5.其他：

*避免支間差異：規(guī)格大于0.1 mL/支裝量的鱟試劑時，為避免支間活性差異帶來的影響，應復溶后混合，再分裝使用。

*若MVD值不是整數(shù)，可以使用小于MVD的整數(shù)進行實驗。

6.重組C因子法

對于含有β葡聚糖干擾的樣品檢測，該原則中給出了“重組C因子法”進行測試。C因子是鱟試劑中對細菌內(nèi)毒素敏感的蛋白，能夠選擇性識別內(nèi)毒素。被細菌內(nèi)毒素活化后，可與熒光底物作用產(chǎn)生與內(nèi)毒素濃度成比例的熒光信號。

重組C因子法試驗需采用熒光酶標儀，激發(fā)/發(fā)射波長一般為: 380 nm/440 nm，檢測溫度一般為37°C ± 1°C。

檢測與除雜

內(nèi)毒素不僅可以通過快速檢測，還可以通過專用的酶標儀配合相關試劑精準檢測。對于實驗用水中的內(nèi)毒素，可以使用專用的超濾設備以及純水機進行測試。91儀器信息網(wǎng)編輯整合了相關資源，為廣大制藥工作者提供參考。

快速檢測平臺

查士利華檢測平臺支持相同的卡片技術，準確、方便、實時檢測內(nèi)毒素和葡聚糖濃度。此外，每個系統(tǒng)都與Charles River Cortex 數(shù)據(jù)管理軟件平臺集成，創(chuàng)建了一個真正強大，可控的內(nèi)毒素檢測程序。

Endosafe nexgen-PTS 新一代便攜式檢測系統(tǒng)

實拍Endosafe nexgen-PTS

15分鐘內(nèi)提供定量鱟實驗結果；FDA認證，檢測范圍在0.005-10 EU/mL；系統(tǒng)便攜，采樣現(xiàn)場直接獲得檢測結果。

Endosafe nexgen-MCS 多卡片式細菌內(nèi)毒素檢測系統(tǒng)

高樣品通量，多個卡片共同測定，疊加的臺式系統(tǒng)；15分鐘內(nèi)可同時檢測5個樣品；樣品獨立檢測，允許隨時插取，無需等待整批取樣。

Endosafe Nexus 全自動細菌內(nèi)毒素檢測系統(tǒng)

消除技術人員在樣品制備上可能造成的差異；客戶僅需要添加帶條形碼的樣品到平臺上即可完成。

鱟試劑專用酶標儀

Thermo Varioskan LUX多功能微孔板讀數(shù)儀

Varioskan LUX多功能微孔板讀數(shù)儀是使用鱟試劑檢測細菌內(nèi)毒素適配的酶標儀。在傳統(tǒng)酶標儀的基礎上，專為內(nèi)毒素檢測優(yōu)化設計光路，可滿足不同鱟試劑檢測需求。單通道檢測，避免了多通道檢測中不同光路之間的差異，另有2個參比通道，確保讀數(shù)的高度精確性。檢測波長范圍340–850 nm，滿足多種鱟試劑檢測需求，可進行動態(tài)顯色法和動態(tài)濁度法檢測。適用于微量96孔板，在提高檢測通量的同時，降低實際成本。

內(nèi)置自我診斷程序，在啟動階段，系統(tǒng)對載板位置、光源和濾光片在內(nèi)的各種相關參數(shù)進行全面的檢測，確保結果的準確可靠內(nèi)置振蕩器及孵育器。最高溫度達50℃，有熱蓋設計保證溫控精確，滿足內(nèi)毒素檢測的溫度。

過濾模塊

Merck——盒式超濾膜包Pellicon 2

超濾去除內(nèi)毒素，使用孔徑小于內(nèi)毒素聚體的膜截留內(nèi)毒素而讓料液通過。使用8kD或者10kD的超濾膜包，內(nèi)毒素截留率通?？梢赃_到99.99%以上。超濾后的液體無相變，無雜質，不影響產(chǎn)品量；可驗證；通量高，產(chǎn)品收率高。設備易于清洗消毒除熱原，可重復使用。

超純水機——去除內(nèi)毒素等雜質

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