數(shù)字PCR(dPCR)具有比傳統(tǒng)qPCR更加出色的靈敏度、特異性和精確度。數(shù)字PCR技術(shù)在極微量核酸樣本檢測、復(fù)雜背景下稀有突變檢測和表達(dá)量微小差異鑒定方面表現(xiàn)出的優(yōu)勢已被普遍認(rèn)可。數(shù)字PCR技術(shù)在基因表達(dá)研究、microRNA研究、基因組拷貝數(shù)鑒定、癌癥標(biāo)志物稀有突變檢測、致病微生物鑒定、轉(zhuǎn)基因成分鑒定、NGS測序文庫精確定量和結(jié)果驗證等諸多方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前數(shù)字PCR市場規(guī)模僅占到熒光PCR儀的1/10，且主流產(chǎn)品多為歐美跨國公司的高端儀器，在科研和臨床的應(yīng)用還比較初步。令人欣喜的是，經(jīng)過中國學(xué)者的不懈努力，我國已經(jīng)在數(shù)字PCR技術(shù)研發(fā)上邁出了一大步。

杜文斌研究員于2007年在美國芝加哥大學(xué)從事博士后工作，開始數(shù)字PCR技術(shù)相關(guān)研究。2011年，杜文斌回國，任中國人民大學(xué)化學(xué)系特聘研究員。2013年，杜文斌加入中國科學(xué)院微生物研究所微生物資源前期開發(fā)國家重點實驗室，同年入選中組部“青年千人計劃”。2014年，杜文斌帶領(lǐng)的中科院微生物所研究團隊研發(fā)出振動微滴制備技術(shù)，并基于此技術(shù)獨立研制了一套獨特的數(shù)字PCR系統(tǒng)。2016年，由他主持的國家重點研發(fā)計劃“數(shù)字診療裝備研發(fā)”專項項目“新一代高通量數(shù)字PCR關(guān)鍵技術(shù)及應(yīng)用研究”啟動。

杜文斌 研究員

91儀器信息網(wǎng)日前對杜文斌研究員進行了專訪，通過與杜文斌研究員交流，以及對其實驗室的觀摩，我們對振動微滴數(shù)字PCR技術(shù)進行了詳細(xì)了解。

在精準(zhǔn)醫(yī)療的大趨勢下，核酸檢測越演越熱。杜文斌團隊開展的關(guān)于數(shù)字PCR的工作主要是針對分子診斷領(lǐng)域。

“和傳統(tǒng)的影像學(xué)、免疫學(xué)相比，分子診斷能夠在發(fā)病早期，即在分子水平突變的情況下檢測到疾病標(biāo)志物，使診斷的窗口期前移，提高治療的有效性，提高生存率”，杜文斌研究員在談到分子診斷時說道，“另外分子診斷在類似病毒載量監(jiān)測和產(chǎn)前篩查都有比較好的應(yīng)用?！?/p>

數(shù)字PCR因為靈敏度高、絕對定量、適合于醫(yī)院操作等優(yōu)點，在分子診斷應(yīng)用方向具有顯著優(yōu)勢。

“蜻蜓點水”般的振動微滴制備技術(shù)

加樣樣品一端連著探針，探針自動吸取樣品，孔板上方振動生成液滴，孔板底部是一個加熱平臺，可以進行加熱擴增，擴增完成在機器內(nèi)進行多通道熒光成像，直接得到檢測結(jié)果。“從最初將樣品放入儀器，到最后直接得到圖像結(jié)果，整個流程只需要3個小時”。杜文斌研究員向我們介紹道。

杜文斌團隊自主研發(fā)的全自動振動微滴數(shù)字PCR一代樣機

振動微滴技術(shù)是一種液滴形成方式，與目前市場上主流數(shù)字PCR儀器廠商微滴形成技術(shù)截然不同：其核心是一個特制的加樣探針，探針可吸取微升體積的樣品，并在特制的孔板上，通過泵出液體時的連續(xù)振動，生成均一大小的納升體積液滴陣列?！斑@個過程類似于蜻蜓點水”，杜文斌研究員形象地介紹說。

振動微滴制備技術(shù)原理及數(shù)字PCR擴增效果

平臺高度集成化 成本降低上百倍

與同類數(shù)字PCR產(chǎn)品相比，杜文斌團隊自主研發(fā)的全自動數(shù)字PCR樣機具有以下特點：

1. 平臺高度集成化：微滴式數(shù)字PCR過程通常包括微滴生成、微滴反應(yīng)以及微滴檢測三個過程。市售微滴式數(shù)字PCR儀通常是將三個過程拆分，一個數(shù)字PCR平臺包含2臺或者3臺儀器。杜文斌團隊研發(fā)的數(shù)字PCR平臺將三個過程高度集成，只需要一臺儀器即可完成自動化操作。

2. 耗材成本低：杜文斌團隊研發(fā)的數(shù)字PCR儀沒有芯片等高昂的耗材費用，唯一的耗材為具有自主知識產(chǎn)權(quán)的特制塑料針管。

3. 結(jié)果準(zhǔn)確度高：杜文斌團隊用自主研發(fā)的數(shù)字PCR裝置與qPCR以及市售某主流型號數(shù)字PCR儀進行了對照試驗，“結(jié)果表明我們的技術(shù)和qPCR試驗結(jié)果是很相近的，和市售某主流型號數(shù)字PCR儀結(jié)果對比，也具有非常好的一致性”。

據(jù)杜文斌研究員介紹，振動微滴PCR技術(shù)與目前市場上主流數(shù)字PCR儀器技術(shù)截然不同，他們自2014年以來已對振動微滴技術(shù)申請了專利，未來很可能產(chǎn)業(yè)化并進軍國際市場。

致力微流控高通量微生物研究技術(shù)平臺開發(fā)

杜文斌團隊多年來從事微流控研究，除數(shù)字PCR技術(shù)研究外，其團隊的研究工作還包括單細(xì)胞測序、臨床病原微生物快速鑒定和藥敏篩查等。

杜文斌研究員所在實驗室為微生物資源前期開發(fā)國家重點實驗室，該實驗室主要從事微生物資源挖掘、利用、產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化等工作。91儀器信息網(wǎng)編輯走進杜文斌團隊所在實驗室，發(fā)現(xiàn)視野所及之處均整齊的擺滿了實驗儀器或者儀器配件。

杜文斌研究員為91儀器信息網(wǎng)編輯講解振動微滴數(shù)字PCR技術(shù)

杜文斌研究員帶領(lǐng)我們參觀他的實驗室的同時，向我們介紹了他和團隊的主要工作方向，“我們團隊一方面，為其他團隊提供高通量的微流控分離篩選平臺，使微生物資源挖掘和菌株改造、進化能夠更加高效；另一方面，也做利用微流控芯片進行分子診斷的工作，如疾病快速診斷和生物安全檢測方面研究?！?/p>

“與傳統(tǒng)研究方法相比，利用微流控實現(xiàn)微生物學(xué)研究具有諸多優(yōu)勢，”杜老師向我們講解說，“首先，傳統(tǒng)方法雖技術(shù)成熟，但是操作繁瑣。利用微流控技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)復(fù)雜重復(fù)性操作的自動化。其次是傳統(tǒng)方法對微生物研究為群落水平，利用微流控技術(shù)，能夠進行單細(xì)胞水平分析。利用微流控技術(shù)還能對單細(xì)胞的微環(huán)境進行控制，從而實現(xiàn)比較精確的群落異質(zhì)性研究，實現(xiàn)復(fù)雜群落的解析?！?/p>

總體來說，杜文斌團隊致力于利用微流控技術(shù)解決傳統(tǒng)微生物研究中樣品復(fù)雜、微生物種類繁多、豐度差異性大、微生物類型(細(xì)菌、真菌、病毒)多的問題。通過微流控技術(shù)，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)單細(xì)胞培養(yǎng)和生理狀態(tài)的研究，也能實現(xiàn)單細(xì)胞的分選、測序。此外，“微流控技術(shù)還能進行分子診斷，尤其是針對臨床微生物的快速診斷?！?/p>

作為中科院微生物所的科研團隊，杜文斌老師表示希望能夠建立一個比較完整的平臺體系用于微生物資源挖掘與鑒定?！巴ㄟ^開發(fā)基于微流控技術(shù)的快速高通量平臺來實現(xiàn)微生物樣品分離、微生物培養(yǎng)、高通量分選、菌種進化選育。”杜文斌表明了團隊下一步工作計劃，“希望我們開發(fā)的技術(shù)平臺不僅能在微生物國家重點實驗室應(yīng)用，也能推廣開來，供廣大科研單位使用”。

后記

1999年數(shù)字PCR的概念正式被提出，2006年第一臺商用數(shù)字PCR儀出現(xiàn)，到現(xiàn)在數(shù)字PCR市場百花齊放，國產(chǎn)數(shù)字PCR技術(shù)發(fā)展蒸蒸日上。采訪中，杜文斌研究員解釋說，發(fā)展數(shù)字PCR技術(shù)有很多切入點，單就微液滴生成的方式都有很多可能。技術(shù)上超越現(xiàn)有成熟數(shù)字PCR技術(shù)廠商是很難的，但是大膽創(chuàng)新、另辟蹊徑，就一定能在這一細(xì)分領(lǐng)域占領(lǐng)一席之地。

主要參考文獻

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