自20世紀(jì)80年代起，質(zhì)譜技術(shù)就已經(jīng)成為科學(xué)研究中用于蛋白分析的強(qiáng)大工具。隨著技術(shù)的不斷成熟和廣泛使用，其在微生物檢驗(yàn)常規(guī)診斷中的作用越來(lái)越受到關(guān)注，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)已經(jīng)進(jìn)入臨床微生物實(shí)驗(yàn)室用于病原菌鑒定，與傳統(tǒng)的表型鑒定及分子生物學(xué)技術(shù)相比，MALDI-TOF MS快速、準(zhǔn)確、成本低廉，且數(shù)據(jù)庫(kù)可不斷更新完善，極大地提高了臨床微生物尤其是微需氧菌、厭氧菌、分枝桿菌及真菌等難培養(yǎng)微生物的鑒定效率,盡管該技術(shù)推向臨床不到10年，現(xiàn)已被公認(rèn)為微生物快速鑒定的里程碑。

MALDI-TOF MS基本原理

MALDI-TOF MS 的離子源通過(guò)激光轟擊待測(cè)樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，使基質(zhì)從中吸收能量并傳遞給生物分子，二者間發(fā)生質(zhì)子( 即電荷) 轉(zhuǎn)移而使生物分子電離。電離的生物分子在電場(chǎng)作用下加速通過(guò)飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的時(shí)間及離子的數(shù)量得到質(zhì)/荷( m/z) 比值及信號(hào)值而形成相應(yīng)的峰圖。

微生物由其自身獨(dú)特的蛋白質(zhì)組成，通過(guò)比對(duì)MALDI-TOF MS 獲得種屬間的特異峰圖( 主要由核糖體蛋白形成，m/z 范圍為2000~20000) 與數(shù)據(jù)庫(kù)中的參考譜圖，根據(jù)同源性距離得到最接近的菌種并給出相應(yīng)的鑒定分值，再依據(jù)實(shí)際情況分析，可得到最終的鑒定結(jié)果。值得一提的是，MALDI與其他電離方式相比具有很多優(yōu)勢(shì),其電離方式為“軟電離”——整個(gè)分子在離子化過(guò)程中都能夠保持完整，得出的質(zhì)譜圖就會(huì)讓不同大小的分子有序排布，這樣就便于我們對(duì)譜圖進(jìn)行分析。而其他電離方式更加激烈一些，會(huì)導(dǎo)致分子碎裂，最后得出的譜圖會(huì)產(chǎn)生很大干擾，造成分析困難。

MALDI-TOF MS的應(yīng)用領(lǐng)域

1.臨床病原微生物

MALDI-TOF MS 不但可用于分純菌落，也可用于某些特定臨床標(biāo)本的直接檢測(cè)，包括陽(yáng)性血培養(yǎng)液、中段尿、腦脊液等樣本中微生物的鑒定。該技術(shù)也可用于臨床病毒感染的診斷、病毒基因分型和流行病學(xué)研究。

2.食源性微生物

該技術(shù)在飲用水被污染的早期就能直接鑒定出病原菌，已成功用于食品微生物的檢測(cè)，并建立了食源性致病菌蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)。

3.環(huán)境微生物

MALDI-TOF MS 在環(huán)境微生物的鑒定中也日益受到重視，例如海洋、大氣、土壤等特定環(huán)境中的潛在致病微生物。以上棲息地的微生物種類(lèi)繁多，MALDI-TOF MS 在準(zhǔn)確鑒定微生物的同時(shí)，將來(lái)自不同環(huán)境和地域的同一種微生物通過(guò)MALDI Biotyper 軟件的聚類(lèi)分析功能進(jìn)行溯源。目前已經(jīng)初步建立了環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫(kù)。

4. 其他領(lǐng)域

MALDI-TOF MS 在新的生物學(xué)標(biāo)志物篩選、新生兒遺傳代謝病臨床應(yīng)用中也具有很好的應(yīng)用前景，有可能成為個(gè)體化醫(yī)療中快速精準(zhǔn)的檢測(cè)技術(shù)。例如先天性甲狀腺功能減退癥、苯丙酮尿癥、囊胞性纖維癥、半乳糖血癥、氧化脂肪酸缺陷癥、有機(jī)酸尿癥和尿素循環(huán)缺陷癥等。

MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)庫(kù)現(xiàn)狀

目前主要有4 種MALDI-TOF MS 系統(tǒng): MALDI Biotyper系統(tǒng)( Bruker Daltonics，德國(guó))；VITEK MS 系統(tǒng)( BioMérieux，Marcy l Etoile，法國(guó))；the AXIMA @ SARAMIS 數(shù)據(jù)庫(kù)( AnagnosTec，德國(guó)) 和the Andromas( Andromas，法國(guó))。而可購(gòu)買(mǎi)到的數(shù)據(jù)庫(kù)有3 種: MALDI Biotyper 數(shù)據(jù)庫(kù)( 布魯克道爾頓，德國(guó)) ，Saramis( BioMérieux，用于來(lái)自Shimadzu 的質(zhì)譜設(shè)備) 和Andromas ( 可與布魯克道爾頓或Shimadzu 硬件兼容)。其中MALDI Biotyper 和VITEK MS 系統(tǒng)已獲得中國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局的許可證，可用于臨床樣本的檢測(cè)。MALDI Biotyper 和VITEK MS 系統(tǒng)對(duì)應(yīng)的臨床微生物基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)分別為Biotyper 2.0 database 和Vitek MS plus Saramis Knowledge base 2.0。Biotyper 2.0 database中包含的菌種豐富，但缺乏志賀菌( 與大腸埃希菌親緣性過(guò)近，常規(guī)比對(duì)算法無(wú)法區(qū)分) ，且分枝桿菌、絲狀真菌、布魯氏菌以及霍亂弧菌等所在數(shù)據(jù)庫(kù)需單獨(dú)購(gòu)買(mǎi); Vitek MS plus Saramis Knowledge base2.0 中包含的菌種少于Biotyper 2.0 database，但擁有霍亂弧菌的數(shù)據(jù)。

對(duì)于其中缺少的菌種，我們除了通過(guò)購(gòu)買(mǎi)其他數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，還可通過(guò)自建數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)加以完善，那么該如何進(jìn)行自建呢?

(1) 通過(guò)生化反應(yīng)或基因測(cè)序鑒定并確認(rèn)待入庫(kù)菌的種名；

(2) 分純單菌落以獲得足量單克隆株；

(3) 樣本制備: 根據(jù)待入庫(kù)菌蛋白質(zhì)提取難度及日后鑒定的需要，靈活選用前處理方法；

(4) 自動(dòng)或手動(dòng)采集質(zhì)譜譜圖；

(5) 譜圖評(píng)估篩選: 選擇20 ～ 24 張質(zhì)量較好的譜圖，減小偶然誤差；

(6) 操作軟件完成建庫(kù)。

MALDI-TOF MS 數(shù)據(jù)庫(kù)擴(kuò)展完善的重要性

數(shù)據(jù)庫(kù)是MALDI-TOF MS 的核心，待檢測(cè)微生物只有在數(shù)據(jù)庫(kù)里有相應(yīng)的質(zhì)譜圖才可能被鑒定。數(shù)據(jù)庫(kù)不僅要包含微生物所有的屬，也應(yīng)包括種，甚至株。質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)完善意義重大，具體原因如下：

1.分類(lèi)詞目不斷增加，新物種不斷被發(fā)現(xiàn)。有時(shí)待測(cè)微生物未能被鑒定出來(lái)是因?yàn)樗切碌奈锓N或分類(lèi)。比如過(guò)氧化物酶陰性的革蘭陽(yáng)性球菌有許多新種類(lèi)，而且其分類(lèi)也在不斷發(fā)展。只有制造商或者用戶(hù)把新發(fā)現(xiàn)的物種添加到數(shù)據(jù)庫(kù)，按照物種分類(lèi)詞目的變化去完善數(shù)據(jù)庫(kù)，才能保證新物種的準(zhǔn)確鑒定。

2.有一些物種遺傳背景很相近，親緣性高，增加了鑒別的難度?，F(xiàn)在還不清楚是否可以通過(guò)優(yōu)化數(shù)據(jù)庫(kù)或者軟件使一些同源性高度相近的微生物的鑒別成為可能，但像這樣的細(xì)節(jié)如果不被考慮，就會(huì)造成鑒定錯(cuò)誤。

3.微生物標(biāo)本有可能來(lái)自不同地域，不同分離基物，有不同分離年限，而且不同地域的優(yōu)勢(shì)菌不同，數(shù)據(jù)庫(kù)中微生物單一的參考質(zhì)譜圖有時(shí)并不能代表分離自其他微生物實(shí)驗(yàn)室的同種典型菌株。所以數(shù)據(jù)庫(kù)中應(yīng)包含同一個(gè)菌種采集的多個(gè)分離株的指紋質(zhì)譜圖，用戶(hù)可以將分離的本地典型菌株作為參考菌株填充到自定義數(shù)據(jù)庫(kù)中，必要時(shí)可考慮對(duì)某些微生物建立本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)，甚至可以建立多地區(qū)數(shù)據(jù)庫(kù)聯(lián)網(wǎng)共享。

4.分枝桿菌、厭氧菌等疑難鑒定微生物，其數(shù)據(jù)庫(kù)的建立和完善更為必要。

5.商業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)環(huán)境微生物的指紋圖譜很少。由于MALDI-TOF MS 越來(lái)越多用于鑒定環(huán)境微生物，因此構(gòu)建環(huán)境微生物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)是新的研究方向。很多研究也表明，質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)的擴(kuò)大可以使鑒定正確率大大提高。例如分枝桿菌在數(shù)據(jù)庫(kù)擴(kuò)展前后的鑒定正確率分別79.3%和94.9%。因此數(shù)據(jù)庫(kù)的更新和完善是運(yùn)用MALDI-TOF MS 技術(shù)正確鑒定微生物的基礎(chǔ)。

MALDI-TOF MS未來(lái)展望

MALDI-TOF MS在不久的將來(lái)肯定會(huì)取代傳統(tǒng)的生化鑒定法，在實(shí)驗(yàn)室大力推廣。在西歐，MALDI-TOF MS已經(jīng)在臨床實(shí)驗(yàn)室使用，目前FDA和美國(guó)抗生素委員會(huì)也正在討論將這一方法在臨床推廣，這也將帶來(lái)細(xì)菌鑒定及耐藥性檢測(cè)的革命。

目前，MALDI-TOF MS仍存在不少問(wèn)題值得繼續(xù)研究改進(jìn)，比如不同的培養(yǎng)基、培養(yǎng)時(shí)間、上樣方式等因素影響實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性、數(shù)據(jù)庫(kù)尚不完善、從原始標(biāo)本中直接進(jìn)行檢測(cè)涉及到的最低細(xì)菌量以及感染性標(biāo)本的防護(hù)、或是在同一標(biāo)本中分離出多種進(jìn)化程度相近的物種則會(huì)難以辨別等等。但是另一方面，由于該項(xiàng)技術(shù)具備快速、靈敏、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、分辨率高、對(duì)原始樣本要求低等優(yōu)點(diǎn)，令其在臨床微生物領(lǐng)域具有很大的發(fā)展前景。隨著科技的不斷進(jìn)步、相信在不久的將來(lái)，MALDI-TOF MS必將成為細(xì)菌鑒定領(lǐng)域的“主力軍”。