肝臟疾病是嚴(yán)重危害人類健康的疾病，其病因復(fù)雜多樣，既包括感染、腫瘤等常見因素，也包括自身免疫性、先天性疾病等特殊因素。臨床最常見的慢性肝病為乙型肝炎病毒(hepatitisB virus，HBV)和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染所致，在世界范圍內(nèi)分別有3.7億和1.3億患者;慢性肝炎通常緩慢進(jìn)展為肝纖維化和肝硬化，最終可能發(fā)展為肝細(xì)胞肝癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)，肝細(xì)胞癌死亡率很高，據(jù)世衛(wèi)組織報道，每年全世界死于HCC的患者約為600 000人，而其中一半死亡病例發(fā)生在中國[1]。除了病毒感染外，藥物和毒物的損害，營養(yǎng)不良和嗜酒，以及代謝異常等因素也是肝臟疾病的主要原因。

　　慢性肝病的診斷對疾病的治療和預(yù)后具有重要的意義，目前對肝炎病毒感染的診斷，通常采用免疫學(xué)或分子生物學(xué)技術(shù)檢測病毒的特異性抗原、抗體或核酸片段，而腫瘤標(biāo)志物及影像學(xué)技術(shù)對HCC的診斷也有廣泛的臨床應(yīng)用。近幾年，隨著技術(shù)的發(fā)展和革新，質(zhì)譜技術(shù)也開始廣泛應(yīng)用于各個醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域，如腫瘤標(biāo)志物篩選、細(xì)菌鑒定、耐藥分析以及病毒檢測等，成為很多臨床實驗室的常規(guī)檢測技術(shù)[2]。

　　一、質(zhì)譜分析技術(shù)發(fā)展?fàn)顩r

　　雖然，世界上第一臺質(zhì)譜儀在20世紀(jì)早期就已研制成功，但直到20世紀(jì)80年代，隨著基質(zhì)輔助激光解析(Matrix–AssistedLaser Desorption/Ionization，MALDI)和電噴霧電離(Electrosprayionization，ESI)等"軟電離"技術(shù)的發(fā)展才使得質(zhì)譜技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。隨后，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，如LC–MS/MS的出現(xiàn)，則極大地推動了質(zhì)譜技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域的發(fā)展。目前應(yīng)用較廣泛的質(zhì)譜技術(shù)包括表面增強激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(surface–enhancedlaser desorption/ionization–time of flight，SELDI–TOF–MS)和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix–AssistedLaser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI–TOF–MS)等，它們是新型的蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)，具有高通量和高速度的優(yōu)勢，目前主要用于腫瘤及其他疾病標(biāo)志物的篩選。但二者的靈敏度和重復(fù)性存在一定缺陷，嚴(yán)重制約了它們在臨床檢測中的應(yīng)用。而且上述技術(shù)只能對目的蛋白或疾病標(biāo)志物進(jìn)行定性檢測，無法反映疾病的嚴(yán)重程度并對疾病進(jìn)行預(yù)后判斷。近年新發(fā)展起來的包括核素標(biāo)記定量(isobarictags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)技術(shù)可對樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)絕對和相對定量研究，具有分離能力強，分析范圍廣的特點，但是，對樣本要求高，樣本處理過程復(fù)雜及高試劑成本是該技術(shù)的主要缺陷?；跉庀嗌V–質(zhì)譜(GasChromatography–Mass Spectrometer，GC/MS)和液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用(LiquidChromatography –Mass Spectrometry，LC/MS)技術(shù)是目前常用的檢測方式，尤其是該技術(shù)在代謝組學(xué)中的研究價值受到學(xué)者的廣泛關(guān)注，代謝組學(xué)的研究對象大都是相對分子質(zhì)量1 000以內(nèi)的內(nèi)源性小分子物質(zhì)，通常采用核磁共振(nuclearmagnetic resonance，NMR)，色譜(high performanceliquid chromatography，HPLC)等技術(shù)分離并檢測人體尿液或血漿等生物樣本中的代謝物譜圖，再結(jié)合模式識別方法，可以判斷出生物體的病理、生理狀態(tài)，并找出與之相關(guān)的生物標(biāo)志物。相比較蛋白質(zhì)組研究，代謝物分子檢測更加容易，并且種類少，更適合作為疾病的標(biāo)志物。

　　二、質(zhì)譜技術(shù)在病毒性肝炎檢測中的應(yīng)用

　　HBV及HCV感染嚴(yán)重威脅著人類健康，目前臨床實驗室主要采用化學(xué)發(fā)光和核酸擴增技術(shù)進(jìn)行病毒抗原、抗體和核酸的檢測。MassARRAY是基于MALDI–TOF–MS的核酸分析技術(shù)，已有學(xué)者將該技術(shù)用于HBV與HCV的血清分型，該方法的主要優(yōu)勢是快速、廉價。另外，該技術(shù)可以檢測病毒的變異，區(qū)分野生株和突變株，指導(dǎo)臨床用藥，但缺點是只能用于HBV的B和C型[3]。

　　HBV突變可導(dǎo)致拉米夫定耐藥，目前主要檢測方法是測序，但耗時長，不適合大樣本量的檢測。Hong SP等采用MALDI–TOF–MS方法進(jìn)行變異位點的檢測，具有更高的靈敏度和特異性，并且可以對HBV感染患者抗病毒藥物治療效果進(jìn)行監(jiān)測[4]。另外，對HCV分型的MALDI–TOF–MS方法也有不少文獻(xiàn)報道[5,6,7]。MALDI–TOF–MS技術(shù)也可用于其他抗病毒藥物耐藥的檢測[8]。

　　三、質(zhì)譜技術(shù)在肝纖維化及肝硬化檢測中的應(yīng)用

　　肝臟活組織檢查是診斷肝纖維化的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法是有創(chuàng)性檢查，患者依從性差，因此臨床迫切需要尋找簡單且易推廣的無創(chuàng)性診斷指標(biāo)用于評估肝纖維化。目前對肝纖維化的無創(chuàng)性診斷方法主要包括影像學(xué)和血清學(xué)指標(biāo)，而質(zhì)譜技術(shù)在尋找新的無創(chuàng)性診斷指標(biāo)中發(fā)揮了很大的作用。Poon的研究組應(yīng)用SELDI–TOF MS技術(shù)尋找與肝纖維化分期相關(guān)的蛋白指紋峰，并利用差異蛋白峰建立了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ArtificialNeural Network，ANN)診斷模型，發(fā)現(xiàn)了5個蛋白峰(m/z為5905, 5928, 5948，3162，3267)與Ishak纖維化評分顯著相關(guān)，ANN模型指數(shù)與纖維化評分呈顯著相關(guān)性(r=0.831)，并且其對肝硬化的預(yù)測正確率可到達(dá)89%，對Ishak>4的纖維化患者預(yù)測靈敏度可達(dá)100%[9]。Marfà等最近報道采用色譜和SELDI–TOFMS技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一個5.9KDa的多肽具有肝臟早期纖維化的診斷價值，隨后證實為纖維蛋白原α鏈的C末端片段。

　　四、質(zhì)譜技術(shù)在酒精性肝病檢測中的應(yīng)用

　　酒精性肝病(alcoholicliver disease，ALD)是由于長期大量飲酒所導(dǎo)致的肝臟疾病。ALD的診斷是基于綜合臨床特征的，包括明確的飲酒史、肝病臨床證據(jù)和血清異常指標(biāo)的支持。但常用的實驗室檢測指標(biāo)在ALD診斷中的靈敏度和特異度均不能滿足臨床的需求，因此研究ALD的特異性診斷指標(biāo)具有重要的現(xiàn)實意義。然而，由于酒精性肝病與其他類型肝病在患者機體生理變化上極其相似，所以尋找ALD特異性的標(biāo)志物非常困難。Nomura的研究組早在2004年就采用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行了這方面的探索，他們的思路是通過對酒精依賴癥患者血清中的差異蛋白進(jìn)行分析，試圖找到具有診斷價值的ALD標(biāo)志物，他們發(fā)現(xiàn)在慢性酒精依賴患者血清中纖維蛋白原aE片段和Apo AII以及色素上皮衍生因子(PEDF)都可能成為酒精依賴的特異性標(biāo)志物]。另一個研究思路是通過對成人酒精攝入前后血清中蛋白質(zhì)的變化來尋找酒精代謝的標(biāo)志物，如Liangpunsakul等[13]采用MALDI–TOF–MS技術(shù)對16例志愿者飲酒前后的血清蛋白質(zhì)譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)一個59 000的蛋白質(zhì)在飲酒后發(fā)生了顯著改變，經(jīng)鑒定該差異蛋白為α–纖維蛋白原，并認(rèn)為該蛋白可以作為ALD的特異性標(biāo)志物。

　　另外，部分學(xué)者通過建立酒精依賴的動物模型，通過質(zhì)譜檢測發(fā)現(xiàn)了部分具有ALD診斷價值的蛋白質(zhì)或代謝物分子，如Zhang L等采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對酒精誘導(dǎo)的小鼠模型進(jìn)行蛋白差異分析，他們提取了肝細(xì)胞的胞漿膜，并用雙向技術(shù)和iTRAQ技術(shù)分別進(jìn)行檢測，結(jié)果共有15個不同的蛋白被檢測出來，其中，角蛋白–8被在兩種不同的方法中均被檢測出有意義，他們認(rèn)為該分子可能在酒精對肝臟的損害中發(fā)揮一定的作用[14,15,16]。

　　五、質(zhì)譜技術(shù)在肝細(xì)胞癌檢測中的應(yīng)用

　　HCC是常見且致死率高的惡性腫瘤，目前臨床使用的甲胎蛋白(alpha–fetalprotein，AFP)一直是HCC診斷的重要指標(biāo)，但AFP診斷HCC的靈敏度只有39%～65%，無法滿足早期診斷和預(yù)后判斷的要求，因此研究新的血清學(xué)標(biāo)志物具有重要的意義。

　　2003年P(guān)oon的研究組采用SELDI–TOF–MS技術(shù)比較慢性肝病組(chronic liver disease，CLD)和HCC患者的血清蛋白指紋圖譜，并根據(jù)差異蛋白建立了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測模型。他們發(fā)現(xiàn)m/z為8944和8811的蛋白峰在兩組之間具有顯著性表達(dá)差異，并且與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，ANN模型可到達(dá)90%的特異性和92%的靈敏度[17]。Liu C等采用MALDI–TOF–MS技術(shù)對60例HCC患者，36例其他肝病患者和46名性別年齡匹配的正常人的血清蛋白質(zhì)譜進(jìn)行比較，他們發(fā)現(xiàn)4471、8936、11670和13752 m/z的蛋白峰具有HCC鑒定的特異性，采用決策樹建立診斷模型，其AUC可達(dá)到0.927[18]。Xiao等[19]采用超高效親水性液相色譜與電噴霧四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(PerformanceLiquid Chromatography–Quadrupole Time of Flight–Mass Spectrometry，UPLC–QTOF–MS)技術(shù)對HCC患者和肝硬化患者血清小分子代謝產(chǎn)物差異進(jìn)行比較，最終，甘氨膽酸(glycocholicacid，GCA)，甘氨脫氧膽酸(glycodeoxy–cholicacid，GDCA)等代謝產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)在HCC組和肝硬化組有顯著差異性，有望成為新的HCC診斷標(biāo)志物。

　　六、展 望

　　生物質(zhì)譜技術(shù)具有高通量、快速等特點，因此在生物大分子研究領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，目前很多具備條件的臨床實驗室也開始引進(jìn)質(zhì)譜儀用于臨床樣本的檢測[20]，例如MALDI–TOF–MS已成功進(jìn)入臨床微生物實驗室，成為細(xì)菌鑒定領(lǐng)域突破性的技術(shù)。在肝病的診斷中，生物質(zhì)譜技術(shù)具有很好地發(fā)展前景，通過質(zhì)譜技術(shù)有可能發(fā)現(xiàn)一些靈敏度高和特異度好的肝病分子標(biāo)志物，可極大地提高目前的肝病診斷水平。

　　(參考文獻(xiàn)：略)