產(chǎn)品及特點(diǎn)

扎伊爾埃博拉病毒(Zaire Ebola Virus,ZEBO)是一種RNA病毒，是一種能引起人類和其他靈長(zhǎng)類動(dòng)物產(chǎn)生埃博拉出血熱的烈性傳染病病毒，其引起的埃博拉出血熱是當(dāng)今世界上致命的病毒性出血熱，感染者癥狀與同為纖維病毒科的馬爾堡病毒極為相似，包括惡心、嘔吐、腹瀉、膚色改變、全身酸痛、體內(nèi)出血、體外出血、發(fā)燒等。死亡率在50%至90%之間，致死原因主要為中風(fēng)、心肌梗塞、低血容量休克或多發(fā)性器官衰竭，因此快速準(zhǔn)確鑒定對(duì)該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用。本產(chǎn)品基于PCR原理開發(fā)。它具有下列特點(diǎn)： 一站式，用于不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每種成分，包括引物和對(duì)照。根據(jù)扎伊爾埃博拉病毒的保守基因序列設(shè)計(jì)的引物，具有良好的特異性。基于染料法qRT-PCR檢測(cè)，靈敏度比常規(guī)RT-PCR高10-100倍，可以達(dá)到至少1000拷貝/反應(yīng)。使用一管式qRT-PCR技術(shù)，RT和PCR兩步在一個(gè)試管內(nèi)完成，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。本產(chǎn)品足夠50次30 L體系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于臨床。

規(guī)格及成分

成  份

編號(hào)

十孔盒包裝

2 qRT-PCR 緩沖液

190101a

500 L（棕色管）

10 qRT-PCR酶混合液

190101b

100 L（紅蓋）

 ROX染料I

190101c

50  L（棕色管）

ROX染料II

190101d

50  L（棕色管）

熒光PCR模板稀釋液

180701

1mL（亮黃蓋）

扎伊爾埃博拉病毒RT-PCR引物混合液

14-30050yw

100  L（白蓋）

扎伊爾埃博拉病毒RT-PCR陽性對(duì)照

（1 10E8拷貝/ L）

14-30050pc

50  L（黃蓋）

天凈沙核酸釋放劑試用裝

61202

20次（1mL，綠蓋）

使用手冊(cè)

14-30050sc

1份

運(yùn)輸及保存

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為12個(gè)月。陽性對(duì)照需要因易污染其他成分需要單獨(dú)放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供RNA段作為陽性對(duì)照。

自備試劑

樣品RNA

使用方法

一、稀釋陽性對(duì)照（以10E2-10E7這6個(gè)10倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原。標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入45 L 熒光PCR模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。在7號(hào)管中加入5 L 1 10E8拷貝/ L 的陽性對(duì)照(本試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1 10E7拷貝/ L的陽性對(duì)照。放冰上待用。換槍頭，在6號(hào)管中加入5 L 1 10E7拷貝/ L 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1 10E6拷貝/ L的陽性對(duì)照。放冰上待用。換槍頭，在5號(hào)管中加入5 L 1 10E6拷貝/ L 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1 10E5拷貝/ L的陽性對(duì)照。放冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。放冰上待用。

二、樣品RNA的制備如果有N個(gè)樣品，必須設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以用10 L上步制備的陽性對(duì)照梯度稀釋液中的第4號(hào)（濃度為1 10E4拷貝/ L，10 L相當(dāng)于1萬拷貝）再加上一定量的水作為制備的陽性對(duì)照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）。可以用水作為制備的陰性對(duì)照。用自選方法純化N+2個(gè)樣品的RNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒RNA提取試劑盒兼容。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送20次免RNA提取的天凈沙核酸釋放劑試用裝

三、設(shè)置RT-PCR反應(yīng)（20 L體系，在樣品制備室進(jìn)行）如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照，6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板），1個(gè)用于PCR陽性對(duì)照（用第4號(hào)陽性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把6個(gè)標(biāo)曲反應(yīng)縮減成1個(gè)，其余不變。在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子后后加）：

成分

N+2個(gè)制備所得樣品

RT-PCR陰性對(duì)照

RT-PCR陽性

對(duì)照（2-7管）

2 qRT-PCR 緩沖液

10 L

10 L

各10 L

口蹄疫病毒RT-PCR

引物混合物

2 L

2 L

各2 L

50 ROX (見注)

0.4 L

0.4 L

各0.4 L

 樣品制備所得RNA模板（來于第8步）

5.6 L

不加

不加

稀釋所得6個(gè)陽性對(duì)照（來于第6步）

不加

不加

各5.6 L（2號(hào)樣到2號(hào)管，3號(hào)樣到3號(hào)管 ）

10 qRT-PCR

酶混合液

2 L

2 L

2 L

注:需使用ROX染料I的機(jī)型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。

需使用ROX染料II的機(jī)型：：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的Chromo4、Opticon（II）Corbett Rotor Gene 3000。

不需要使用ROX的機(jī)型：Thermal Cycle Dice Real Time System， LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000、RotorGene 6000。上機(jī)后按下面參數(shù)進(jìn)行RT-PCR（參數(shù)可能會(huì)因儀器不同而需優(yōu)化）。

過程

溫度

時(shí)間

RT（逆轉(zhuǎn)錄）

50℃

15-30分鐘

預(yù)變性

94℃

2分鐘

RT - PCR反應(yīng)

（30個(gè)循環(huán)）

95℃

15 秒

60℃

15 秒（采集FAM通道的熒光信號(hào)）

72℃

15 秒

按儀器預(yù)設(shè)程序進(jìn)行溶解曲線分析數(shù)據(jù)處理如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度。如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。

關(guān)聯(lián)產(chǎn)品

扎伊爾埃博拉病毒可視化RT-LAMP檢測(cè)試劑盒