2020年11月，廣東省微生物研究所許玫英與楊永剛研究員團(tuán)隊(duì)在期刊《Appl Environ Microbiol》上發(fā)表文章“Visualizing and isolating iron-reducing microorganisms at single cell level”，論文第一作者為助理研究員甘翠芬。該論文在線后被環(huán)境微生物學(xué)領(lǐng)域著名專家DR Lovley教授評(píng)為“One of the most exciting papers in microbial iron reduction of 2020 ”

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一、研究背景

在自然環(huán)境中，鐵還原是細(xì)菌胞外電子傳遞的主要形式之一。鐵還原菌（FeRM）不僅在礦物和腐殖質(zhì)的還原中起關(guān)鍵作用，而且還參與硫化合物和有機(jī)物的氧化。此外，F(xiàn)eRM在廢水處理、生物修復(fù)和生物電化學(xué)系統(tǒng)等許多工程過(guò)程中至關(guān)重要。鐵還原菌在系統(tǒng)發(fā)育上普遍存在，目前還沒(méi)有合適的16S rRNA或基于功能基因的檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。本文章作者合成了一種對(duì)Fe2+具有高靈敏度和選擇性的耗氧Fe2+特異性熒光化學(xué)探針（FSFC）。該FSFC可以從純培養(yǎng)、不同細(xì)菌共培養(yǎng)或含沉積物樣品中選擇性地鑒定和定位活性FeRM。FSFC的熒光強(qiáng)度可以作為細(xì)菌培養(yǎng)物中Fe2+濃度的指標(biāo)。與單細(xì)胞分選技術(shù)相結(jié)合，該探針可以幫助從豐富的沉積物群落中識(shí)別和分離FeRM。

二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

首先作者設(shè)計(jì)合成了一種對(duì)Fe2+具有高靈敏性和選擇性的特異性熒光探針（FSFC），F(xiàn)SFC能夠定位和鑒定具有活性的FeRM，其熒光強(qiáng)度能夠作為細(xì)菌培養(yǎng)物中Fe2+濃度指示。將FSFC熒光探針與單細(xì)胞分選技術(shù)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)可視化識(shí)別和分選鐵還原菌。

三、結(jié)果與討論

1. FSFC的靈敏度、選擇性和穩(wěn)定性

由于碲原子對(duì)萘二甲酰亞胺熒光團(tuán)的重原子作用，在沒(méi)有Fe2+的情況下，F(xiàn)SFC是非熒光的，F(xiàn)e2+可以觸發(fā)FSFC的脫氫反應(yīng)并引起強(qiáng)烈的熒光，研究表明不同濃度Fe+對(duì)FSFC熒光強(qiáng)度具有影響，并且熒光強(qiáng)度與Fe2+濃度呈現(xiàn)線性關(guān)系，因此，對(duì)于大多數(shù)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)樣品，F(xiàn)SFC可以作為Fe2+或鐵還原菌的指示劑。接下來(lái)作者驗(yàn)證FSFC的選擇性，實(shí)際環(huán)境中其他金屬離子可能會(huì)影響FSFC對(duì)Fe2+的熒光影響，通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明所有被測(cè)金屬分別對(duì)FSFC沒(méi)有顯著的影響效應(yīng)。并且穩(wěn)定性測(cè)試實(shí)驗(yàn)表明FSFC在5h內(nèi)保持較好的穩(wěn)定性，優(yōu)于經(jīng)典的鄰菲羅啉法。

Fig.1 FSFC對(duì)Fe2+溶液中的靈敏度、選擇性和穩(wěn)定性。(A) FSFC熒光光譜對(duì)不同濃度Fe2+的響應(yīng)。(B) Fe2+濃度與熒光強(qiáng)度FI的關(guān)系為對(duì)數(shù)關(guān)系。(C) FSFC對(duì)Fe2+的選擇性測(cè)試。(D) FSFC與傳統(tǒng)鄰菲羅啉法的相對(duì)穩(wěn)定性。

2. 活性FeRM還原可溶性和固態(tài)Fe3+的熒光成像。

前人的研究已經(jīng)廣泛證實(shí)了Shewanella和Geobacter的還鐵能力。此外，有報(bào)道稱，在用FeRM法還原鐵的過(guò)程中，磷酸亞鐵和碳酸亞鐵在細(xì)胞表面聚集。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與非鐵還原菌相比S12和MR-1細(xì)菌表面的Fe2+濃度高很多。使用S. decolorationis S12、S. oneidensis MR-1、G. sulfurreducens PCA三種模式鐵還原菌進(jìn)行可溶性檸檬酸鐵還原時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞熒光強(qiáng)度與二價(jià)鐵濃度呈良好的線性關(guān)系（圖2 A-E, G）。

Fe在自然界中主要以固體的形式存在，本研究發(fā)現(xiàn)上述模式菌在還原無(wú)定形水鐵礦的過(guò)程中的Fe2+濃度也與熒光強(qiáng)度呈一致性變化趨勢(shì)。值得關(guān)注的是，在用于Geobacter無(wú)定形鐵還原測(cè)試時(shí)，僅有接觸鐵顆粒的細(xì)胞呈現(xiàn)熒光，而未接觸鐵顆粒的細(xì)胞幾乎無(wú)熒光（圖2F），與該菌依賴直接接觸的鐵還原方式一致，表明FSFC具有判斷細(xì)菌細(xì)胞是否正在進(jìn)行鐵還原的能力。

Fig.2 FSFC在氧、可溶性Fe3+或固態(tài)Fe3+為電子受體的情況下對(duì)菌株P(guān)CA的熒光響應(yīng)。

3. 評(píng)價(jià)不同細(xì)菌的鐵還原能力。

除鐵還原能力外，不同屬細(xì)菌通常具有不同的形狀、表面性質(zhì)和代謝物，這些都可能影響FSFC的熒光。為了進(jìn)一步分析FSFC的選擇性，我們使用FSFC對(duì)5個(gè)盲菌標(biāo)本進(jìn)行了檢測(cè)。從沉積物中分離出五種還原鐵性能未知的細(xì)菌。

實(shí)驗(yàn)表明，與預(yù)期的結(jié)果一樣， S12和 MR-1顯示熒光，陰性對(duì)照無(wú)熒光。在5個(gè)盲樣細(xì)菌中，只有P. motobuensis Iβ12有熒光，但FI低于S12。其余細(xì)菌均無(wú)熒光(圖4A-G)，所以不同細(xì)菌的貼還原能力差異較大，且FSFC探針對(duì)不同菌的評(píng)價(jià)結(jié)果與經(jīng)典鄰菲羅啉法一致。

 Fig.4：FSFC對(duì)含有檸檬酸鐵的不同細(xì)菌培養(yǎng)物的熒光圖像。 (A) Ciceribacter sp. F217, (B) S. hydrophobicum C1, (C) Bacillus Iβ8, (D) L. varians GY32, (E) P. motobuensis Iβ12, (F) S. decolorationis S12, (G)基于鄰菲羅啉法的不同菌株的鐵還原測(cè)定。

4. FeRM與其他細(xì)菌共培養(yǎng)

FeRM和與其他功能的細(xì)菌共培養(yǎng)是了解FeRM與其他細(xì)菌之間相互作用的重要方法。

為了測(cè)試FSFC是否可以在共培養(yǎng)系統(tǒng)中鑒定出FeRM，作者使用乳酸作為電子供體共培養(yǎng)了絲狀非FeRM 菌株GY32和桿狀菌株S12。如圖5A所示，桿狀菌株S12顯示出強(qiáng)熒光，而絲狀細(xì)菌GY32在相同的鐵還原培養(yǎng)物中沒(méi)有熒光?？梢钥闯?，F(xiàn)SFC可以選擇性地選擇微生物樣品中的FeRM。為了評(píng)價(jià)FSFC在更復(fù)雜環(huán)境下的可行性，用FSFC在含檸檬酸鐵的滅菌底泥中共培養(yǎng)GY32和S12。圖5C顯示在沒(méi)有共培養(yǎng)的沉積物中，只有少數(shù)顆粒顯示熒光，這可能是由于這些沉積物顆粒上固有的Fe 2+引起的，而沒(méi)有細(xì)菌樣顆粒顯示出熒光。 結(jié)果表明，F(xiàn)SFC在沉積物中的背景熒光很小，沉積物中非活性微生物不能觸發(fā)FSFC的熒光。 在共培養(yǎng)系統(tǒng)中，如圖5D顯示，S12表現(xiàn)出顯著的熒光，而絲狀細(xì)菌GY32沒(méi)有熒光，表明FSFC在含沉積物的環(huán)境中可視化FeRM的可行性。

Fig.5 S12和GY32共培養(yǎng)的熒光圖像

5.可視化并從混合物中分離單細(xì)胞FeRM

除了可視化FeRM外，從多物種樣品中分離FeRM對(duì)于了解鐵相關(guān)的生物地球化學(xué)過(guò)程是一個(gè)普遍而重要的需要。作者結(jié)合FSFC和PI來(lái)標(biāo)記富鐵還原反應(yīng)中的生物膜。CLSM顯示，活躍的FeRM細(xì)胞主要位于生物膜的外層，而內(nèi)層生物膜細(xì)胞活性較低，F(xiàn)SFC熒光較少，如圖6A. 7個(gè)有熒光的單細(xì)胞和6個(gè)沒(méi)有熒光的單細(xì)胞通過(guò)單細(xì)胞分選儀從沉積物富集的菌群中分離出來(lái)(圖6)。其中有3個(gè)分離的熒光單細(xì)胞被成功培養(yǎng)，它們都可以使用醋酸鹽作為電子供體來(lái)還原檸檬酸鐵(圖6G)，進(jìn)一步證實(shí)了FSFC在FeRM分選中的可靠性。

Fig.6 基于FSFC可視化單細(xì)胞分選鐵還原菌。

四、結(jié)論

這項(xiàng)研究報(bào)告了一種方法，該方法可以將FeRM可視化并從含有多物種甚至沉積物的細(xì)菌培養(yǎng)物中分離出來(lái)。FSFC對(duì)Fe2+具有很高的靈敏度，選擇性和穩(wěn)定性，并且在液體和沉積物環(huán)境中均具有低背景熒光。 在含有FeRM的純培養(yǎng)物或共培養(yǎng)物中，F(xiàn)SFC可以選擇性地觀察活性FeRM。通過(guò)與單細(xì)胞分選技術(shù)相集成，可以從單細(xì)胞水平的樣品中有效地獲得目標(biāo)FeRM。 這種新穎的方法可能是獲得新的FeRM以及深入了解FeRM在不同環(huán)境中的生物地球化學(xué)作用的有力工具。

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