熒光是一種效應(yīng)，1852年George Gabriel Stokes首次對(duì)其進(jìn)行描述。他發(fā)現(xiàn)，螢石在紫外線照射下開(kāi)始發(fā)光。熒光是一種光致發(fā)光形式，光致發(fā)光是一種材料以光照射后發(fā)射光子的現(xiàn)象。發(fā)射光的波長(zhǎng)比激發(fā)光長(zhǎng)。這種效應(yīng)稱(chēng)為斯托克斯位移。

Wymke Ockenga

德國(guó)馬爾堡菲利普斯大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)與細(xì)胞病理學(xué)研究所?

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An Introduction to Fluorescence - Original Article Leica Science Lab.

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熒光用作顯微技術(shù)的工具

熒光廣泛應(yīng)用于顯微技術(shù)中，并用作觀察特定分子分布的重要工具。細(xì)胞中大部分分子不發(fā)熒光。因此，它們必須以熒光分子（熒光物）標(biāo)記。目標(biāo)分子可以直接標(biāo)記（比如DNA使用DAPI標(biāo)記），或用與特定抗體結(jié)合的熒光物進(jìn)行免疫染色。免疫染色通常需要固定細(xì)胞。

熒光顯微技術(shù)還可用于活細(xì)胞或組織的延時(shí)成像。為此，可用基因編碼的熒光分子（如GFP，綠色熒光蛋白）標(biāo)記目標(biāo)蛋白。還可以用可逆結(jié)合的合成染料（如fura-2）或轉(zhuǎn)基因天然存在蛋白（如GFP衍生物）標(biāo)記目標(biāo)分子（如Ca2+）。

電子能態(tài)的改變導(dǎo)致發(fā)冷光

發(fā)冷光即發(fā)生光效應(yīng)，由電子從激發(fā)態(tài)轉(zhuǎn)移到較低能態(tài)而引起。電子可以以不同的能態(tài)存在?；鶓B(tài)是電子非常穩(wěn)定的狀態(tài)，這時(shí)電子的能量最低。如果電子吸收能量，它們可以躍遷至較高的能級(jí)，即激發(fā)態(tài)。由于激發(fā)態(tài)的能量多于基態(tài)，電子返回其基態(tài)時(shí)必須釋放能量。能量可以通過(guò)發(fā)射光子的形式釋放。

發(fā)冷光有若干種形式，不同點(diǎn)在于系統(tǒng)的激發(fā)方式。例如，在電致發(fā)光中，系統(tǒng)由電流激發(fā)；化學(xué)發(fā)光是因?yàn)榘l(fā)生化學(xué)反應(yīng)；而光致發(fā)光由光子激發(fā)引起。

光致發(fā)光可以進(jìn)一步分為兩個(gè)亞組，即熒光和磷光。熒光與磷光之間的主要差異是發(fā)光的持續(xù)時(shí)間。光照停止時(shí)，熒光立刻結(jié)束。相較之下，磷光可在激發(fā)結(jié)束后持續(xù)數(shù)小時(shí)。

熒光機(jī)理

以對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)的光照射時(shí)，熒光物才發(fā)熒光。波長(zhǎng)取決于熒光團(tuán)的吸收光譜，而且必須確保傳遞適當(dāng)數(shù)量的能量，以將電子提升至激發(fā)態(tài)。電子被激發(fā)后，它們停留在這個(gè)高能態(tài)的時(shí)間非常短。電子經(jīng)過(guò)弛豫過(guò)程回到基態(tài)或能級(jí)較低的另一個(gè)狀態(tài)時(shí)，能量以光子形式釋放。這個(gè)過(guò)程損失一些能量，相較于被吸收的光，熒光物發(fā)射的光波長(zhǎng)較大且能量較低。

磷光機(jī)理

磷光分子的發(fā)光時(shí)間明顯長(zhǎng)于熒光物，因此它們儲(chǔ)存激發(fā)能的途徑肯定不一樣。產(chǎn)生這種差異的根本原因是存在兩種形式的激發(fā)能級(jí)，即單重激發(fā)態(tài)和三重激發(fā)態(tài)，它們基于不同的自旋排列。

自旋是電子的一個(gè)屬性。簡(jiǎn)言之，自旋描述電子本身旋轉(zhuǎn)造成的角動(dòng)量。電子自旋的方向可以是正的（+1/2），也可以是負(fù)的（–1/2）。高能級(jí)自旋對(duì)的彼此朝向可以是平行的，也可以是反平行的。在反平行自旋對(duì)中，各個(gè)角動(dòng)量互相補(bǔ)償，總自旋的值為零。這種自旋排列稱(chēng)為單重態(tài)。兩個(gè)平行的自旋沒(méi)有補(bǔ)償效應(yīng)，數(shù)值不等于零。在這種情況下，自旋處在三重態(tài)中。

電子從單重激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)產(chǎn)生熒光。但是，在一些分子中，激發(fā)電子的自旋可以轉(zhuǎn)變?yōu)槿貞B(tài)，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為系間竄越。這些電子損失能量，直至它們處于三重基態(tài)。這個(gè)狀態(tài)的能量高于基態(tài)，但低于單重激發(fā)態(tài)。因此，電子不能轉(zhuǎn)回到單重態(tài)，也不能輕易地回到基態(tài)，因?yàn)橛捎诹孔恿W(xué)的緣故，只允許數(shù)值為零的總自旋。所以，分子被其能態(tài)捕捉。

但是，每次也會(huì)發(fā)生從三重基態(tài)返回基態(tài)的現(xiàn)象。這些變化引起光子釋放，產(chǎn)生磷光。由于每次只能出現(xiàn)一些變化，因此三重基態(tài)起到能量庫(kù)的作用，從而可在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生磷光。

發(fā)冷光在顯微技術(shù)中的應(yīng)用

對(duì)于顯微技術(shù)，熒光是最有用的發(fā)光類(lèi)型。通過(guò)特定光源（如燈和濾光系統(tǒng)或激光），可以使用特定的波長(zhǎng)輕松地激發(fā)熒光物，而且可以通過(guò)波長(zhǎng)區(qū)分發(fā)射光和激發(fā)光（斯托克斯位移）。

實(shí)驗(yàn)人員可以使用熒光成像來(lái)表征細(xì)胞內(nèi)某種分子的數(shù)量和定位。熒光顯微技術(shù)的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)使用若干個(gè)熒光物。只要求熒光物的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)不一樣。因此，可以同時(shí)觀察不同的目標(biāo)分子，這意味著可以同時(shí)進(jìn)行眾多研究，例如共存研究。