關(guān)于多肽合成,多肽的基本常見知識

1. 我該如何處理和保存多肽？

凍干粉形式的多肽，經(jīng)密封包裝可在常溫條件下穩(wěn)定運輸，溶解狀態(tài)的多肽不宜長期保存。

多肽保存指南：需要長期保存的多肽，應(yīng)以凍干粉形式存放在含有干燥劑的密封容器內(nèi)，置于-20°C保存，-80°C效果更好，可以最大限度地避免多肽降解。這種儲存方式可以使多肽可保存數(shù)年，避免了被細菌降解和氧化，也可以避免二級結(jié)構(gòu)的形成。

打開包裝： 在打開包裝和稱重前，請先將多肽在干燥器中平衡至室溫。因多肽往往具有吸濕性，未經(jīng)平衡到室溫的多肽在打開蓋子后易凝結(jié)，從而降低了多肽產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

稱重： 迅速稱取您所需的多肽，并將剩余多肽繼續(xù)儲存在-20°C或更低溫度。與其他多肽相比，含有半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和谷氨酸N -末端的多肽保存期更短。

2. 如何溶解多肽？

多肽的溶解性很大程度上取決于多肽的極性。酸性的蛋白溶解于堿性溶液，而堿性蛋白可溶解于酸性溶液，含有大量不帶電荷的極性氨基酸殘基或疏水性氨基酸的疏水性多肽和中性多肽可先溶解于少量有機溶劑中，如DMSO、DMF、醋酸、乙腈、甲醇、丙醇或異丙醇，然后加水（蒸餾水）稀釋。含有甲硫氨酸或半胱氨酸的多肽不能用DMSO溶解，因為DMSO可能造成側(cè)鏈氧化。

多肽溶解測試： 在多肽溶解之前先取小部分進行多肽溶解測試，您需要測試幾種不同的溶劑，直到找到最適當(dāng)?shù)囊环N。超聲處理有助于打碎顆粒并增加溶解度。（注意: 超聲處理會引起溶液發(fā)熱和多肽降解。）

將每個酸性氨基酸賦值為－1，包括天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）、以及羧基末端-COOH。每個堿性氨基酸賦值為＋1，包括精氨酸（R）、賴氨酸（K）、組氨酸（H）以及氨基末端-NH2。然后計算整個多肽的電荷數(shù)。

如果整段肽所帶電荷是陽性的，說明該肽是堿性的。可先嘗試用蒸餾水來溶解；如果不溶于水，接著嘗試用少量10%-25%醋酸溶解，如果仍然失敗的話，添加一些TFA（10-50微升）來增溶，然后用水稀釋至理想濃度。

如果整段肽所帶電荷是陰性的，說明該肽是酸性的。酸性的多肽可以嘗試用PBS（PH 7.4）來溶解，如果不溶的話，添加少量的堿性溶劑，如0.1 M的碳酸氫銨，然后加水稀釋至理想濃度。含有游離半胱氨酸的多肽應(yīng)溶于脫氣的酸性緩沖液中，因為當(dāng)PH值大于7時，巰基會被迅速氧化成二硫化物。

如果整段肽電荷是零，說明肽是中性的。中性肽通常溶于有機溶劑。首先，嘗試添加少量乙腈、甲醇或異丙醇。對于高度疏水的多肽，可使用少量的二甲基亞砜溶解，然后用水稀釋至理想濃度。對于含有自由半胱氨酸的肽，需使用DMF而不是DMSO。對于有聚集傾向的肽，可添加6M鹽酸胍或8M尿素，然后進行必要的稀釋。

為了防止或盡量減少多肽降解，請將多肽以凍干粉形式保存在-20°C，-80°C更佳。如果需要保存溶液肽，最好分成小樣存放，以避免反復(fù)凍融。一份樣品融凍后未用完，應(yīng)扔掉。細菌降解有時會成為溶液肽的麻煩，所以請將肽溶于無菌水或肽溶液過濾除菌。

堿性氨基酸: K, R, H, N-terminus

酸性氨基酸: D, E, C-terminus

極性中性氨基酸: F, I, L, M, V, W, Y

非極性疏水氨基酸: G, A, S, T, C, N, Q, P, 乙?；０坊?/p>

舉例說明：

RKDEFILGASRHD: (+5) + (-4) = +1 認(rèn)為是堿性多肽，見步驟2

EKDEFILGASEHR: (+4) + (-5) = -1 認(rèn)為是酸性多肽，見步驟3

AKDEFILGASEHR: (+4) + (-4) = 0 認(rèn)為是中性多肽，見步驟4

3.一個肽段是否可溶能預(yù)測嗎？

我們無法通過研究多肽的結(jié)構(gòu)來預(yù)測其在水中的溶解度。然而，賴氨酸的ε-氨基和精氨酸的胍通常有助于預(yù)測溶解度，尤其是短肽。與此相反，含有天門冬氨酸和谷氨酸的酸性肽往往是不易溶于水的，但易溶于稀氨水或堿性緩沖液。

4. 如何選擇適合自己研究的多肽純度？

粗品肽不推薦用于生物實驗。粗肽可能含有大量的非肽類雜質(zhì)，如殘留的有機溶劑、清除劑、TFA和其他不完整肽。TFA不能被完全消除，通常交付的肽以TFA鹽的形式存在。如果殘留的TFA影響您的實驗，我們推薦其他鹽形式，如醋酸鹽和鹽酸鹽等。這些鹽通常比常規(guī)TFA鹽貴20-30%以上。這是由于在轉(zhuǎn)化過程中出現(xiàn)更多的肽損失和需要更多的原材料。

建議對各種項目采用以下級別的肽純度：

70% 肽純度

肽微陣列

作為制備抗體的抗原

層析法

酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測抗血清滴度

80% 肽純度

免疫印跡法（非定量）

酶底物肽（非定量）

封閉肽（非定量）

親和純化

磷酸化檢測

蛋白電泳的應(yīng)用和免疫細胞化學(xué)

95% 肽純度

標(biāo)準(zhǔn)酶聯(lián)免疫吸附試驗和RIA（定量）

受體配體相互作用（定量）

體內(nèi)、體外 生物學(xué)測定

酶的研究和阻斷實驗（定量）

NMR研究

質(zhì)譜分析

其他定量檢測

98% 肽純度

SAR研究

臨床試驗

APIs(藥物活性成分)

工業(yè)品

X-ray晶體研究

其他敏感的實驗：酶與底物、受體與配體相互作用、阻斷和競爭實驗

5. 什么是多肽的純度？

多肽的純度是指HPLC方法在214nm處檢測到的目標(biāo)多肽的含量(214nm是肽鏈的吸收波長)，紫外分光光度計檢測不到水和殘留的鹽不。可發(fā)現(xiàn)其他的雜質(zhì)包括：缺失序列（缺失了一個或多個氨基酸殘基的靶序列），截斷序列（加帽過程中產(chǎn)生的序列）脫保護不完全序列（產(chǎn)生于整個合成過程或最后的裂解過程）。

多肽純化不涉及水和鹽。HPLC純化會產(chǎn)生少量的TFA，如：游離的氨基末端和其他側(cè)鏈如Arg、Lys、His都可生成少量TFA雜質(zhì)。通常交付的多肽多含有微量TFA和殘留水。即使處于凍干狀態(tài)，水也會因共價結(jié)合的能力不同而不同程度地存在著。

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