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小編今天主要分享基于新技術(shù)的生物學(xué)活性測定方法，此方法可應(yīng)用于抗體類藥物的活性評價(jià)，包括表面等離子共振效價(jià)測定法、均相時(shí)間分辨熒光、 Alpha技術(shù)、熒光染料標(biāo)記法等。
表面等離子共振效價(jià)測定法
表面等離子共振技術(shù)（SurfacePlasmonResonance，SPR）是一種用于生物分子間相互作用分析的新技術(shù)，在抗體藥物的研發(fā)、生產(chǎn)以及質(zhì)量控制方面取得了良好的應(yīng)用。近年來該技術(shù)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域比較新穎，在技術(shù)方面不斷更新，在靈敏度、特異性以及實(shí)用性取得了較大的進(jìn)步。此外在抗體制藥行業(yè)中占據(jù)著巨大的優(yōu)勢。
表面等離子共振現(xiàn)象是發(fā)生在兩種折射率不同的介質(zhì)界面上的一種光學(xué)現(xiàn)象。當(dāng)光源的一束入射光從高折射率介質(zhì)(如玻璃)射向低折射率介質(zhì)(如溶液)的界面時(shí)，如果入射角大于一定的臨界角，入射光將會被100%地反射至光源的同一側(cè)，這叫做全反射現(xiàn)象。當(dāng)兩種介質(zhì)之間有一層極薄的金屬膜(最為常見的50nm金膜)，這時(shí)入射光的能量將會引起金膜中等離子體的共振并以一種電磁場(稱作消逝波)的方式彌散至低折射率介質(zhì)一側(cè)(如溶液)，從而導(dǎo)致反射光的能量在某個(gè)特定的角度降至最低，這一角度被稱作SPR角[1]，因此可以通過對生物反應(yīng)過程中SPR角的動態(tài)變化獲取生物分子之間相互作用的特異信號。該技術(shù)的樣品消耗量較低，一般僅有微克級；也無需預(yù)先標(biāo)記熒光、二抗的分子；同時(shí)使用親和力信息及動力學(xué)信息來闡述分子間結(jié)合機(jī)理。
圖1 SPR技術(shù)作用原理[2]
均相時(shí)間分辨熒光
均相時(shí)間分辨熒光（homogeneous time-resolved fluorescence，HTRF）是用來檢測純液相體系中待測物的一種常用方法，也是用來研究藥物靶標(biāo)的理想平臺。該技術(shù)結(jié)合了熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET，F(xiàn)luorescence Resonance Energy Transfer）和時(shí)間分辨熒光（TRF，Time Resolved Fluorescence)）兩種技術(shù)。HTRF技術(shù)是利用了供體（如Eu穴狀化合物，長壽命熒光）和受體（如XL665，短壽命熒光）之間接近時(shí)產(chǎn)生的熒光共振能量轉(zhuǎn)移。因?yàn)镋u的熒光衰減周期較長，所以含Eu的供體會誘導(dǎo)XL665受體長時(shí)間地發(fā)射熒光，受體激發(fā)后產(chǎn)生的熒光便能持續(xù)較長時(shí)間，通過時(shí)間分辨就可以區(qū)分那些短壽命的自身散射的熒光，這樣從短壽命熒光背景中就很容易區(qū)分出FRET信號[3]，此信號與結(jié)合產(chǎn)物形成成正比，采用雙波長激發(fā)光可以檢測生物分子相互作用下的熒光信號變化，減少緩沖液和介質(zhì)的干擾。
HTRF技術(shù)進(jìn)入藥物研發(fā)領(lǐng)域以來，加快了很多基于抗體的研究，因?yàn)镠TRF具有同等的檢測范圍和檢測極限，不需要洗滌步驟，實(shí)驗(yàn)方式操作簡單，而且減少了實(shí)驗(yàn)時(shí)間和花費(fèi)。所以該技術(shù)近年來已被應(yīng)用于抗體的活性檢測。圖2 HTRF技術(shù)原理[4]
Alpha技術(shù)
近年來，Alpha技術(shù)（Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay）也應(yīng)用于抗體的活性檢測，該技術(shù)需要兩個(gè)由不同的化學(xué)混合物組成的微珠，分別為供體微珠(Donorbeads)和受體微珠(Acceptorbeads)。兩種微珠分別行使不同的功能，其中供體微珠包含了光敏劑苯二甲藍(lán)(Phthalocyanine)，在680nm激光的照射下，它周圍環(huán)境中的氧分子轉(zhuǎn)化成一種高能活躍的氧狀態(tài)-單體氧(Singlet Oxygen)。供體微珠能夠產(chǎn)生大約60,000個(gè)左右的單體氧小分子，10在4 s的半衰期內(nèi)，單體氧可以在溶液中擴(kuò)散高達(dá)200nm的距離。如果在該范圍內(nèi)存在受體微珠，單體氧就會觸發(fā)受體微珠的二甲基噻吩衍生物，繼而通過激發(fā)一系列的化學(xué)反應(yīng)，最終在520-620nm產(chǎn)生光信號，從而達(dá)到檢測目的[5]。
圖3 Alpha技術(shù)作用原理[6]
隨著各類新型生物標(biāo)志物以及藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，尤其是近年來抗體等生物大分子的迅猛發(fā)展，Alpha技術(shù)依靠其自身的優(yōu)勢和特點(diǎn)，能夠應(yīng)用到各個(gè)研究領(lǐng)域，包括血管生成、癌癥、心血管、炎癥、等多種疾病領(lǐng)域。特別是在藥物研發(fā)領(lǐng)域，由于其供穩(wěn)定的、高靈敏的、可自動化的、可重復(fù)且低成本的特點(diǎn)，它將會受到越來越多的科研工作者的青睞。
熒光染料標(biāo)記法
在近幾年飛速發(fā)展的研究進(jìn)展中，熒光染料標(biāo)記法已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)標(biāo)記、DNA檢測、醫(yī)藥衛(wèi)生和環(huán)境檢測等領(lǐng)域。近年來BODIPY(氟化硼二吡咯)類熒光染料作為一類新型的熒光染料，由于其優(yōu)良的性質(zhì)和廣闊的應(yīng)用前景在過去的二十年內(nèi)得到廣泛的研究。與其它的熒光染料相比，BODIPY類熒光染料的光譜峰寬比較窄、檢測靈敏度較高、較高的摩爾吸光系數(shù)、光穩(wěn)定性能非常優(yōu)越以及較高的熒光量子產(chǎn)率等。
例如，抗PCSK9單抗的的生物活性測定即是用BODIPY標(biāo)記的低密度脂蛋白(LDL)通過HepG2細(xì)胞來測定其生物活性。Evolocumab是一款靶向PCSK9的單克隆抗體。當(dāng)它與PCSK9結(jié)合后，能抑制PCSK9結(jié)合低密度脂蛋白受體（LDL-R）。在沒有藥物存在的情況下，這些LDL-R通過與PCSK9的結(jié)合，會被降解。而在evolocumab的作用下，LDL-R能逃脫被降解的厄運(yùn)，回到肝細(xì)胞表面，清除血液里的低密度脂蛋白，從而降低血液中的低密度脂蛋白膽固醇水平[7]。抗PCSK9抗體能夠與PCSK9結(jié)合，阻滯PCSK9與LDLR結(jié)合，增加LDLR數(shù)目，從而增加HepG2細(xì)胞中BODIPY標(biāo)記的LDL熒光量。
圖4 PCSK9抑制劑的作用機(jī)制[8]
參考資料
[1] 王蘭，徐岡，等. 抗體類生物治療藥物活性測定方法. 中國生物工程雜志，2015，35（6）：101 108
[2] 朱磊，高凱，等．單克隆抗體生物治療藥物研究進(jìn)展．中國藥學(xué)雜志，2014，49（23）：2058-2064．
[3] http://meeting.dxy.cn/Cisbio2011/article/i15729.html
[4] Fran ois Degorce, Amy Card, et al. HTRF: A Technology Tailored for Drug Discovery A Review of Theoretical Aspects and Recent Applications. Current Chemical Genomics, 2009, 3, 22-32
[5] https://med.sina.com/article_detail_103_2_11911.html
[6] https://data.pharmacodia.com
[7] http://m.sohu.com/a/160671003_282570?_f=m-article_24_feeds_3
[8] PharmDr.Anna Ole rov , PhD., MPH,et al. Novel targeted therapeutics in dyslipoproteinemia, Prakt. lekarn., 2015; 5(3-4): 92 96
咳咳...今天的科普就介紹到這啦，抗體的愛究竟有多深，不妨用這幾種方法測試測試哦，幫你選出那個(gè)更對的Mr.right~
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