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色譜柱篩選是一種簡(jiǎn)單而又功能強(qiáng)大的方法, 可以快速識(shí)別最合適的色譜柱。
通過(guò)篩選2種不同的流動(dòng)相有機(jī)改性劑可以使方法更全面。
以下的流程圖總結(jié)了如何通過(guò)4個(gè)簡(jiǎn)單步驟執(zhí)行方法開(kāi)發(fā)篩選。
開(kāi)始
第一步：選擇流動(dòng)相pH和緩沖液
根據(jù)分析物性質(zhì) (即pKa, logP和logD數(shù)據(jù)) 進(jìn)行選擇。對(duì)于未知分析物，使用酸性流動(dòng)相作為起點(diǎn)。
第二步：使用ACE 方法包 (3或6支色譜柱)
梯度掃描以MeOH和MeCN作為有機(jī)溶劑,進(jìn)行5-95％梯度篩選。
第三步：查看數(shù)據(jù)
選擇最佳色譜柱和有機(jī)改性劑。
第四步：方法優(yōu)化
如有必要, 檢查溫度, pH值, 梯度斜率,梯度范圍等。
是否實(shí)現(xiàn)分離？
是-方法開(kāi)發(fā)完成
否-改變流動(dòng)相條件（pH值,緩沖液等），回到第二步繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。
選擇色譜柱和粒徑尺寸。
由LC系統(tǒng)和用戶的偏好決定。對(duì)于400 bar的HPLC系統(tǒng)來(lái)說(shuō), 5 m 150 x 4.6mm是個(gè)不錯(cuò)的選擇。
對(duì)于600 bar優(yōu)化的HPLC系統(tǒng), 可使用2 和3 m粒徑的較短色譜柱 (如100mm)。1.7 m粒徑的短柱 (如50mm)適用于UHPLC系統(tǒng)。
如何確定合適的篩選梯度時(shí)間？
梯度時(shí)間可以使用公式1計(jì)算。
VM可用公式2計(jì)算。
tG = 梯度時(shí)間 (mins.)
k* = 梯度保留系數(shù) (通常設(shè)置約為5)
= 梯度范圍 (即對(duì)于5-95％B梯度， = 0.9)
VM = 柱內(nèi)體積 (mL)
S = 5 對(duì)于小分子 (＜1000沓)
F = 流速 (mL/min)
L = 色譜柱長(zhǎng)度 (mm)
dc = 柱內(nèi)徑 (mm）
請(qǐng)務(wù)必記住在下一次注射前, 在梯度洗脫后以至少10倍VM (柱內(nèi)體積) 進(jìn)行一次等度重新平衡。
為何使用色譜柱篩選？
改變色譜柱的固定相可能對(duì)選擇性造成顯著影響 (圖1)。
在相同的流動(dòng)相條件下, 篩選不同的色譜柱可以幫助您以更高的分辨率更快地實(shí)現(xiàn)所需的分離。
圖1：改變色譜柱固定相的影響。
色譜柱：50x2.1mm
流動(dòng)相：A = 0.1％甲酸的水溶液，B = 含0.1%甲酸的甲醇:水(9:1 v/v)
梯度：5分鐘內(nèi)3-100%B，
流速：0.06mL/min
溫度：40 C
檢測(cè)：UV，254nm
樣品：1）甲硝唑，2）芐醇，3）氫氯噻嗪，4）香草醛，5）羥苯甲酯，6）1,2-二硝基苯
ACE MDKs將具有不同相互作用機(jī)制的色譜柱組合在一起, 以最大限度地提高選擇性并增加分離具有挑戰(zhàn)性的混合物的可能性。
性價(jià)比高, ACE MDKs與單支色譜柱價(jià)格相同！
兩種最受歡迎的ACE反相 (RP) MDK (參見(jiàn)下表) 包括了為利用不同的保留機(jī)制和最大化選擇性而獨(dú)特設(shè)計(jì)的相。
所有六個(gè)相都可以在反相 (RP) 條件下使用, 并且具有與C18一樣的穩(wěn)定性。
1近似值 通過(guò)半定量機(jī)制加權(quán)和/或通過(guò)參考使用 100特征分析物的其他ACE相來(lái)確定。
其他的ACE方法包還有HILIC分析包, 生物大分子300 分析包和實(shí)心核(UltraCore) 分析包
同樣提供微孔柱尺寸 (內(nèi)徑0.5和1.0mm)。
成功范例
對(duì)乙酰氨基酚及有關(guān)物質(zhì)
基于分析物的pKa和logD來(lái)選擇流動(dòng)相pH值。
使用MeOH或MeCN作為最常見(jiàn)的方法開(kāi)發(fā) (C18）的起點(diǎn)無(wú)法分離所有的分
析物。所以, 需要進(jìn)一步的方法開(kāi)發(fā)。
使用6支色譜柱/2次流動(dòng)相篩選, 即刻就可識(shí)別6種方案。
無(wú)須進(jìn)一步的方法開(kāi)發(fā)了！
