顯微鏡觀察和照像

  特異性的熒光所發(fā)射的光線比起照明所需的總光度來(lái)說(shuō)是較為
暗淡的。因此，由像汞弧高真空燈泡所發(fā)出的那種高強(qiáng)度光線對(duì)于
獲得明亮的免疫熒光來(lái)說(shuō)是一個(gè)最為起碼的要求．

  雖然熒光素和繞丹寧強(qiáng)烈吸收300 nm以下的光線，但由于光學(xué)
系統(tǒng)很難將光線聚集在這一范圍內(nèi)而無(wú)法作為常規(guī)使用．對(duì)于這兩
種熒光色索來(lái)說(shuō)，第二個(gè)最大吸．收峰太接近于發(fā)射峰：在熒光顯
微鏡下觀察是靈敏的，因?yàn)樗l(fā)射的光線是在黑暗的背景中觀察的
。為了這一目的，重要的是只能見到發(fā)射的熒光而不能見到照明的
光線。由于只有部分的照明光線被吸收，因而必須把未被吸收掉的
部分與發(fā)射的熒光分離開來(lái)．如果照明光線和發(fā)射的熒光的峰值很

接近，那么就無(wú)法將它們分開．因而，當(dāng)用熒光素和繞丹寧進(jìn)行免
疫熒光檢查時(shí)常常使用近紫外區(qū)和短波藍(lán)色的光線來(lái)作為照明光線
．在這樣的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，熒光素和繞丹寧二者都吸收，盡管不像用
較短的或較長(zhǎng)波長(zhǎng)的光線時(shí)那樣有效。在照明光線和樣品之間所使
用的濾光片提供了這一波長(zhǎng)范圍并使得組織所產(chǎn)生的自身熒光減到
最小。

  次級(jí)濾光片放在樣品和目鏡之間以保留發(fā)出的熒光光線而截?cái)?br>任何的激發(fā)光線。因此，次級(jí)濾光片應(yīng)該能夠?qū)⑼ㄟ^(guò)初級(jí)濾光片的
光線都阻斷在使用雙重染色技術(shù)時(shí)，需要將較弱的繞丹寧熒光與熒
光素的強(qiáng)熒光進(jìn)行對(duì)比，

  因此最好是同時(shí)激發(fā)兩個(gè)波長(zhǎng)的光線而不只是一個(gè)，這樣就能夠
獨(dú)立地改變對(duì)于熒光素最適合的激發(fā)光和對(duì)乎繞丹寧最適合的激發(fā)
光線的強(qiáng)度。

射出的熒光。然而，暗視野照明卻大大簡(jiǎn)化了對(duì)于濾光片的選擇，
因?yàn)榧词共挥脼V光片也保證大部分的照明光線不能夠達(dá)到目鏡，而
只能看到熒光發(fā)射出來(lái)的光線。在實(shí)踐中，暗視野聚光器通常是與
濾光片一同使用的。在油浸物鏡下觀察免疫熒光時(shí)用甘油來(lái)代替浸
鏡油。

  照像是必需的，因標(biāo)本在貯存過(guò)程中會(huì)褪掉熒光。熒光強(qiáng)度的
這種減弱對(duì)于照像技術(shù)本身也是一個(gè)重要的因素：在做暗視野顯微鏡
觀察時(shí)總光線強(qiáng)度常很低，特別是當(dāng)只有切片的一小部分發(fā)射熒
光時(shí)。因此，曝光時(shí)間就趨于很長(zhǎng)。然而，在進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間曝光的過(guò)
程中，熒光強(qiáng)度本身亦逐漸消褪。故應(yīng)嘗試用最可能短的曝光時(shí)問(wèn)
；因此，有人便推薦了具有高ASA等級(jí)的底片。除此之外，還需要
一個(gè)非常標(biāo)準(zhǔn)化的自動(dòng)曝光表，因?yàn)楣饩€的測(cè)量與曝光是同步的，
而在進(jìn)行曝光期間熒光的任何減低都會(huì)自動(dòng)地得到補(bǔ)償．

  在進(jìn)行照像的樣品經(jīng)過(guò)繞丹寧和FITC結(jié)合的抗體雙重染色時(shí)，
重要的是要理解熒光素的熒光比繞丹寧熒光的壽命要短。在試圖保
持FITC熒光方面，相當(dāng)普遍的做法是在對(duì)組織進(jìn)行細(xì)致的觀察之前
先照下像來(lái)。當(dāng)照像之后再觀察組織時(shí)，大部分的染色可能已消失
，因面觀測(cè)的結(jié)果不得不全然依靠暗視野照片．

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