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如表1所示，MassPREP肽混合物(部件編號186002337)使用0.1%FA水溶液重新溶解，使總肽濃度大約為0.6 mg/mL。
結(jié)果與討論
肽分離
MassPREP肽混合物含有9種不同的肽，氨基酸組成、質(zhì)量、長度和極性各有不同。肽序列如表1所示。由于該混合物由這樣一組多樣的肽組成，所以對于評價質(zhì)譜性能和色譜性能是很有用的。鑒于此，相對于其他常用于肽分析的固定相，肽混合物被用作檢測CSH130 C18的分離性能。本研究還包括用于高效分離混合物中大孔徑肽(100 ? ~ 300 ?)的固定相，這些肽的分子量均低于 3kDa。另一個單獨的應(yīng)用紀(jì)要對使用130 ?孔徑的CSH130 C18分離更大的多肽進行了討論。11為了研究相關(guān)性，使混合物中每種肽的上樣量與抗體肽圖所用的常用條件接近，其中20 ~ 50 μg的Lys-C消化液或胰蛋白酶消化液一般在內(nèi)徑為2.0 mm或2.1 mm的色譜柱上進行分析。2,12-13同樣，分離使用含有強離子對試劑TFA、較弱的離子對試劑FA或兩者結(jié)合的流動相完成。肽反相分離通常與質(zhì)譜聯(lián)用，在各種條件下得到的性能頗引人注意。在這些應(yīng)用中，因為甲酸能夠提供靈敏度更高的檢測，所以選用甲酸而非三氟乙酸作為流動相添加劑。14-15
圖1是在不同的流動相條件下使用一根5 μm硅膠C18色譜柱得到的三張MassPREP的色譜圖。使用TFA進行分離得到的色譜峰一般都是對稱的。大部分色譜峰并未出現(xiàn)過度的峰展寬或拖尾的現(xiàn)象。但是，使用含有甲酸的流動相得到的峰形極不理想。此外，混合物中最大的肽——蜂毒素并未被檢測出來，原因可能是峰過寬或根本沒洗脫出來。對于使用HPLC進行的肽分離，這樣的結(jié)果是很常見的。
使用亞2 μm顆?？勺岆姆蛛x的性能更加優(yōu)越。在兩種均以1.7 μm顆粒填充的色譜柱上得到的色譜圖見圖2和圖3。特別是圖2中的色譜圖，它們使用表面多孔型C18色譜柱得到。在流動相中加入TFA時，得到的色譜峰是對稱的，并且一般比使用5 μm多孔型C18色譜柱得到的色譜峰更窄，如圖1所示。在流動相中加入極少量TFA或者不加TFA時，色譜峰變寬并出現(xiàn)明顯拖尾。在所有測試條件下，全多孔BEH130 C18色譜柱分離的效果與表面多孔型C18色譜柱相當(dāng)，如圖3所示。
圖1至圖3表示的分離用于檢測CSH130 C18,1.7 μm色譜柱肽分析的性能。對應(yīng)的色譜圖如圖4所示。圖1至圖4的對比清楚表明，無論是使用含有TFA還是FA的流動相，與其他色譜柱不同的是，CSH130 C18都能夠提供最佳的峰形。此外，可以明顯看到，CSH130 C18 表現(xiàn)出獨一無二的選擇性——尤其使用不含TFA的流動相情況下。例如，在流動相中僅加入0.1%的甲酸，在本研究所用的其他任何色譜柱上(CSH130 C18除外)，肽8和肽9均未得到很好的分離。而使用CSH130 C18時，這兩種洗脫是峰形對稱并在3分鐘以上的時間內(nèi)分實現(xiàn)分離。另外，這些色譜柱之間也存在保留能力的差異。最值得注意的是，CSH130 C18色譜柱的保留能力稍弱于本研究涵蓋的其他色譜柱。這正好印證了CSH130 C18是唯一一種表面帶有少量正電荷吸附劑的事實。帶正電荷的肽與CSH130 C18表面之間的庫侖斥力很可能是CSH130 C18保留能力較低的原因。圖4的插圖顯示了在CSH130 C18色譜柱上使用0.1%FA梯度時的最早洗脫部分。在這些條件下，親水性最強的肽RASG-1(肽1)在孔隙體積標(biāo)記附近出峰。與BEH130 C18色譜柱相比，一般使用CSH130 C18洗脫肽時所使用的ACN的量要少2% ~ 4%。 使用0.1%TFA時，保留能力的差異最小，而使用0.1%FA時，保留能力差異最大。分析極性很大的肽時，CSH130 C18的初始梯度條件可能需要作相應(yīng)的調(diào)整。
峰容量和質(zhì)譜信號
對這些定性分離的比較表明CSH130 C18比其他色譜柱具有性能上的優(yōu)勢。但是，定量更引人注目。在每個分離中觀察到的峰容量按照實驗部分的方法計算。圖5A顯示了在每種色譜柱上酸性改進劑組成與峰容量之間的關(guān)系。圖5A的左部分是僅使用FA而不使用TFA離子對試劑得到的峰容量值。沿X軸向右是與FA濃度降低、TFA濃度升高時對應(yīng)的峰容量值。CSH130 C18色譜柱的性能優(yōu)勢很容易顯現(xiàn)出來。使用0.1%TFA時，CSH130 C18色譜柱的峰容量比其他1.7 μm C18色譜柱大20%。但是，如果使用含有0.1%甲酸的流動相，CSH130 C18色譜柱的峰容量比其他 1.7 μm色譜柱大90%。因此，CSH130 C18不僅比其他色譜柱具有更大的峰容量，而且其性能對三氟乙酸的依賴性很小。由此帶來的最明顯效果是CSH130 C18色譜柱與質(zhì)譜具有很高的兼容性。在這些分析中，三氟乙酸對肽質(zhì)譜檢測的影響見圖5B。我們知道，在電噴霧離子化過程中，TFA會引起嚴(yán)重的離子抑制16-17。因此，使用TFA而不使用FA時，質(zhì)譜信號降低12倍。CSH130 C18色譜柱并不需要太多TFA(如果有)來獲得最佳峰容量，因此成為需要高靈敏度LC/MS應(yīng)用的理想選擇。
粒徑和UPLC/HPLC的放大性
許多肽分離操作仍在傳統(tǒng)的HPLC儀器上進行。因其背壓過高，使用亞2 μm填充的色譜柱通常不適合與HPLC系統(tǒng)聯(lián)用。而2.5 μm色譜柱因其背壓較低可以在任何LC儀器上使用。為確定CSH130 C18,1.7μm色譜柱得到的峰容量是否可以成功轉(zhuǎn)移到CSH130 C18 XP,2.5 μm色譜柱上，針對2.5 μm XP色譜柱設(shè)置了一種從一根1.7μm色譜柱轉(zhuǎn)移出來的HPLC兼容的方法。這種轉(zhuǎn)移如下所述：按照ACQUITY UPLC色譜柱計算器的建議18，將流速降低，增加梯度時間，降低和增加的系數(shù)均為1.5。圖6顯示，使用1.7 μm色譜柱進行的分離成功地轉(zhuǎn)移到了2.5μm?XP色譜柱上。選擇性系數(shù)的一致性強調(diào)了這一觀察結(jié)果，如表2所示。與1.7顆粒的色譜柱相比，使用2.5μm?XP顆粒進行分離時背壓出現(xiàn)極大地降低(~3000psi比 ~8000 psi)，從而表明了CSH技術(shù)可以輕松應(yīng)用于UPLC或HPLC進行的高峰容量肽分離中。
結(jié)論
由于創(chuàng)新性的施加了低水平的正電荷，CSH 130 C18色譜柱已經(jīng)被證明是一種能夠?qū)崿F(xiàn)肽分離的技術(shù)。根據(jù)對9種肽混合物進行分析，我們發(fā)現(xiàn)，與非表面帶電的C18色譜柱相比，CSH 130 C18顯示出更高的峰容量和獨一無二的選擇性。經(jīng)過觀察，CSH 130 C18色譜柱的性能對強離子對試劑(例如TFA，可以抑制電噴霧離子化)的依賴性顯著降低。此外，在背壓較小的HPLC條件下，使用CSH 130 C18,1.7 μm色譜柱得到的分離結(jié)果可以轉(zhuǎn)移到CSH 130 C18,2.5 μm XP色譜柱上——盡管以犧牲分析時間為代價。CSH 130 C18可以使用不同的粒徑，便于采用UPLC作為常規(guī)使用(以往這些實驗室的日常使用被限制在HPLC儀器上)，也可以拓展到壓力上限為9000~12000psi的 UHPLC上。
參考文獻(xiàn)
1. Yates JR, Ruse CI, Nakorchevsky A. Proteomics by mass spectrometry: approaches, advances, and applications. Annu Rev Biomed Eng. 2009; 11: 49-79. 2. Richardson J, Shah B, Xiao G, Bondarenko PV, Zhang Z. Automated in-solution protein digestion using a commonly available high-performance liquid chromatography autosampler. Anal Biochem. 2011; 411(2): 284-91. 3. Neue UD. Theory of peak capacity in gradient elution. J Chromatogr A. 2005; 1079(1-2): 153-61. 4. Wyndham KD, O’Gara JE, Walter TH, Glose KH, Lawrence NL, Alden BA, Izzo GS, Hudalla CJ, Iraneta PC. Characterization and evaluation of C18 HPLC stationary phases based on ethyl-bridged hybrid organic/inorganic particles. Anal Chem. 2003; 75(24): 6781-8. 5. Iraneta PC, Wyndham KD, McCabe DR, Walter TH. Charged Surface Hybrid (CSH) Technology and Its Use in Liquid Chromatography. Waters White Paper 720003929EN. 2011.
6. Berthelette KD, Summers M, Fountain KJ. Modernization of the USP Assay for Clarithromycin Using eXtended Performance (XP) Column Technology. Waters Application Note 720004461EN. 2012. 7. Fountain KJ, Hewitson HB, Iraneta PC, Morrison D. Practical Applications of Charged Surface Hybrid (CSH) Technology. Waters Application Note 720003720EN. 2010. 8. Summers M, Fountain KJ. A Quality by Design (QbD) Based Method Development for the Determination of Impurities in a Peroxide Degraded Sample of Ziprasidone. Waters Application Note 720004072EN. 2011. 9. Summers M, Fountain KJ. Rapid Method Development through Proper Column Selection. Waters Application Note 720004353EN. 2012. 10. ACQUITY UPLC CSH Columns. Waters Applications Notebook 720003537EN. 2010. 11. Lauber MA, Koza SM, Fountain KJ. Peptide Mapping and Small Protein Separations with Charged Surface Hybrid (CSH) C18 and TFA-Free Mobile Phases. Waters Application Note. 720004571EN. 2013. 12. Yan B, Yates Z, Balland A, Kleemann GR. Human IgG1 hinge fragmentation as the result of H2O2-mediated radical cleavage. J Biol Chem. 2009; 284(51): 35390-402. 13. Yu XC, Joe K, Zhang Y, Adriano A, Wang Y, Gazzano-Santoro H, Keck RG, Deperalta G, Ling V. Accurate determination of succinimide degradation products using high fidelity trypsin digestion peptide map analysis. Anal Chem. 2011; 83(15):5912-9. 14. Annesley TM. Ion suppression in mass spectrometry. Clin Chem. 2003; 49(7): 1041-4. 15. Temesi D, Law B. LC-GC Int. 1999;17: 626-32. 16. Apffel A, Fischer S, Goldberg G, Goodley PC, Kuhlmann FE. Enhanced sensitivity for peptide mapping with electrospray liquid chromatography-mass spectrometry in the presence of signal suppression due to trifluoroacetic acid-containing mobile phases. J Chromatogr A. 1995;712(1): 177-90. 17. Kuhlmann FE, Apffel A, Fischer S, Goldberg G, Goodley PC. J Am Soc Mass Spectrom. 1995; 6 (12): 1221-1225. 18. Jones M D, Alden P, Fountain KJ, Aubin A. Waters Application Note 720003721EN. 2010.
結(jié)果與討論
肽分離
MassPREP肽混合物含有9種不同的肽，氨基酸組成、質(zhì)量、長度和極性各有不同。肽序列如表1所示。由于該混合物由這樣一組多樣的肽組成，所以對于評價質(zhì)譜性能和色譜性能是很有用的。鑒于此，相對于其他常用于肽分析的固定相，肽混合物被用作檢測CSH130 C18的分離性能。本研究還包括用于高效分離混合物中大孔徑肽(100 ? ~ 300 ?)的固定相，這些肽的分子量均低于 3kDa。另一個單獨的應(yīng)用紀(jì)要對使用130 ?孔徑的CSH130 C18分離更大的多肽進行了討論。11為了研究相關(guān)性，使混合物中每種肽的上樣量與抗體肽圖所用的常用條件接近，其中20 ~ 50 μg的Lys-C消化液或胰蛋白酶消化液一般在內(nèi)徑為2.0 mm或2.1 mm的色譜柱上進行分析。2,12-13同樣，分離使用含有強離子對試劑TFA、較弱的離子對試劑FA或兩者結(jié)合的流動相完成。肽反相分離通常與質(zhì)譜聯(lián)用，在各種條件下得到的性能頗引人注意。在這些應(yīng)用中，因為甲酸能夠提供靈敏度更高的檢測，所以選用甲酸而非三氟乙酸作為流動相添加劑。14-15
圖1是在不同的流動相條件下使用一根5 μm硅膠C18色譜柱得到的三張MassPREP的色譜圖。使用TFA進行分離得到的色譜峰一般都是對稱的。大部分色譜峰并未出現(xiàn)過度的峰展寬或拖尾的現(xiàn)象。但是，使用含有甲酸的流動相得到的峰形極不理想。此外，混合物中最大的肽——蜂毒素并未被檢測出來，原因可能是峰過寬或根本沒洗脫出來。對于使用HPLC進行的肽分離，這樣的結(jié)果是很常見的。
使用亞2 μm顆?？勺岆姆蛛x的性能更加優(yōu)越。在兩種均以1.7 μm顆粒填充的色譜柱上得到的色譜圖見圖2和圖3。特別是圖2中的色譜圖，它們使用表面多孔型C18色譜柱得到。在流動相中加入TFA時，得到的色譜峰是對稱的，并且一般比使用5 μm多孔型C18色譜柱得到的色譜峰更窄，如圖1所示。在流動相中加入極少量TFA或者不加TFA時，色譜峰變寬并出現(xiàn)明顯拖尾。在所有測試條件下，全多孔BEH130 C18色譜柱分離的效果與表面多孔型C18色譜柱相當(dāng)，如圖3所示。
圖1至圖3表示的分離用于檢測CSH130 C18,1.7 μm色譜柱肽分析的性能。對應(yīng)的色譜圖如圖4所示。圖1至圖4的對比清楚表明，無論是使用含有TFA還是FA的流動相，與其他色譜柱不同的是，CSH130 C18都能夠提供最佳的峰形。此外，可以明顯看到，CSH130 C18 表現(xiàn)出獨一無二的選擇性——尤其使用不含TFA的流動相情況下。例如，在流動相中僅加入0.1%的甲酸，在本研究所用的其他任何色譜柱上(CSH130 C18除外)，肽8和肽9均未得到很好的分離。而使用CSH130 C18時，這兩種洗脫是峰形對稱并在3分鐘以上的時間內(nèi)分實現(xiàn)分離。另外，這些色譜柱之間也存在保留能力的差異。最值得注意的是，CSH130 C18色譜柱的保留能力稍弱于本研究涵蓋的其他色譜柱。這正好印證了CSH130 C18是唯一一種表面帶有少量正電荷吸附劑的事實。帶正電荷的肽與CSH130 C18表面之間的庫侖斥力很可能是CSH130 C18保留能力較低的原因。圖4的插圖顯示了在CSH130 C18色譜柱上使用0.1%FA梯度時的最早洗脫部分。在這些條件下，親水性最強的肽RASG-1(肽1)在孔隙體積標(biāo)記附近出峰。與BEH130 C18色譜柱相比，一般使用CSH130 C18洗脫肽時所使用的ACN的量要少2% ~ 4%。 使用0.1%TFA時，保留能力的差異最小，而使用0.1%FA時，保留能力差異最大。分析極性很大的肽時，CSH130 C18的初始梯度條件可能需要作相應(yīng)的調(diào)整。
峰容量和質(zhì)譜信號
對這些定性分離的比較表明CSH130 C18比其他色譜柱具有性能上的優(yōu)勢。但是，定量更引人注目。在每個分離中觀察到的峰容量按照實驗部分的方法計算。圖5A顯示了在每種色譜柱上酸性改進劑組成與峰容量之間的關(guān)系。圖5A的左部分是僅使用FA而不使用TFA離子對試劑得到的峰容量值。沿X軸向右是與FA濃度降低、TFA濃度升高時對應(yīng)的峰容量值。CSH130 C18色譜柱的性能優(yōu)勢很容易顯現(xiàn)出來。使用0.1%TFA時，CSH130 C18色譜柱的峰容量比其他1.7 μm C18色譜柱大20%。但是，如果使用含有0.1%甲酸的流動相，CSH130 C18色譜柱的峰容量比其他 1.7 μm色譜柱大90%。因此，CSH130 C18不僅比其他色譜柱具有更大的峰容量，而且其性能對三氟乙酸的依賴性很小。由此帶來的最明顯效果是CSH130 C18色譜柱與質(zhì)譜具有很高的兼容性。在這些分析中，三氟乙酸對肽質(zhì)譜檢測的影響見圖5B。我們知道，在電噴霧離子化過程中，TFA會引起嚴(yán)重的離子抑制16-17。因此，使用TFA而不使用FA時，質(zhì)譜信號降低12倍。CSH130 C18色譜柱并不需要太多TFA(如果有)來獲得最佳峰容量，因此成為需要高靈敏度LC/MS應(yīng)用的理想選擇。
粒徑和UPLC/HPLC的放大性
許多肽分離操作仍在傳統(tǒng)的HPLC儀器上進行。因其背壓過高，使用亞2 μm填充的色譜柱通常不適合與HPLC系統(tǒng)聯(lián)用。而2.5 μm色譜柱因其背壓較低可以在任何LC儀器上使用。為確定CSH130 C18,1.7μm色譜柱得到的峰容量是否可以成功轉(zhuǎn)移到CSH130 C18 XP,2.5 μm色譜柱上，針對2.5 μm XP色譜柱設(shè)置了一種從一根1.7μm色譜柱轉(zhuǎn)移出來的HPLC兼容的方法。這種轉(zhuǎn)移如下所述：按照ACQUITY UPLC色譜柱計算器的建議18，將流速降低，增加梯度時間，降低和增加的系數(shù)均為1.5。圖6顯示，使用1.7 μm色譜柱進行的分離成功地轉(zhuǎn)移到了2.5μm?XP色譜柱上。選擇性系數(shù)的一致性強調(diào)了這一觀察結(jié)果，如表2所示。與1.7顆粒的色譜柱相比，使用2.5μm?XP顆粒進行分離時背壓出現(xiàn)極大地降低(~3000psi比 ~8000 psi)，從而表明了CSH技術(shù)可以輕松應(yīng)用于UPLC或HPLC進行的高峰容量肽分離中。
結(jié)論
由于創(chuàng)新性的施加了低水平的正電荷，CSH 130 C18色譜柱已經(jīng)被證明是一種能夠?qū)崿F(xiàn)肽分離的技術(shù)。根據(jù)對9種肽混合物進行分析，我們發(fā)現(xiàn)，與非表面帶電的C18色譜柱相比，CSH 130 C18顯示出更高的峰容量和獨一無二的選擇性。經(jīng)過觀察，CSH 130 C18色譜柱的性能對強離子對試劑(例如TFA，可以抑制電噴霧離子化)的依賴性顯著降低。此外，在背壓較小的HPLC條件下，使用CSH 130 C18,1.7 μm色譜柱得到的分離結(jié)果可以轉(zhuǎn)移到CSH 130 C18,2.5 μm XP色譜柱上——盡管以犧牲分析時間為代價。CSH 130 C18可以使用不同的粒徑，便于采用UPLC作為常規(guī)使用(以往這些實驗室的日常使用被限制在HPLC儀器上)，也可以拓展到壓力上限為9000~12000psi的 UHPLC上。
參考文獻(xiàn)
1. Yates JR, Ruse CI, Nakorchevsky A. Proteomics by mass spectrometry: approaches, advances, and applications. Annu Rev Biomed Eng. 2009; 11: 49-79. 2. Richardson J, Shah B, Xiao G, Bondarenko PV, Zhang Z. Automated in-solution protein digestion using a commonly available high-performance liquid chromatography autosampler. Anal Biochem. 2011; 411(2): 284-91. 3. Neue UD. Theory of peak capacity in gradient elution. J Chromatogr A. 2005; 1079(1-2): 153-61. 4. Wyndham KD, O’Gara JE, Walter TH, Glose KH, Lawrence NL, Alden BA, Izzo GS, Hudalla CJ, Iraneta PC. Characterization and evaluation of C18 HPLC stationary phases based on ethyl-bridged hybrid organic/inorganic particles. Anal Chem. 2003; 75(24): 6781-8. 5. Iraneta PC, Wyndham KD, McCabe DR, Walter TH. Charged Surface Hybrid (CSH) Technology and Its Use in Liquid Chromatography. Waters White Paper 720003929EN. 2011.
6. Berthelette KD, Summers M, Fountain KJ. Modernization of the USP Assay for Clarithromycin Using eXtended Performance (XP) Column Technology. Waters Application Note 720004461EN. 2012. 7. Fountain KJ, Hewitson HB, Iraneta PC, Morrison D. Practical Applications of Charged Surface Hybrid (CSH) Technology. Waters Application Note 720003720EN. 2010. 8. Summers M, Fountain KJ. A Quality by Design (QbD) Based Method Development for the Determination of Impurities in a Peroxide Degraded Sample of Ziprasidone. Waters Application Note 720004072EN. 2011. 9. Summers M, Fountain KJ. Rapid Method Development through Proper Column Selection. Waters Application Note 720004353EN. 2012. 10. ACQUITY UPLC CSH Columns. Waters Applications Notebook 720003537EN. 2010. 11. Lauber MA, Koza SM, Fountain KJ. Peptide Mapping and Small Protein Separations with Charged Surface Hybrid (CSH) C18 and TFA-Free Mobile Phases. Waters Application Note. 720004571EN. 2013. 12. Yan B, Yates Z, Balland A, Kleemann GR. Human IgG1 hinge fragmentation as the result of H2O2-mediated radical cleavage. J Biol Chem. 2009; 284(51): 35390-402. 13. Yu XC, Joe K, Zhang Y, Adriano A, Wang Y, Gazzano-Santoro H, Keck RG, Deperalta G, Ling V. Accurate determination of succinimide degradation products using high fidelity trypsin digestion peptide map analysis. Anal Chem. 2011; 83(15):5912-9. 14. Annesley TM. Ion suppression in mass spectrometry. Clin Chem. 2003; 49(7): 1041-4. 15. Temesi D, Law B. LC-GC Int. 1999;17: 626-32. 16. Apffel A, Fischer S, Goldberg G, Goodley PC, Kuhlmann FE. Enhanced sensitivity for peptide mapping with electrospray liquid chromatography-mass spectrometry in the presence of signal suppression due to trifluoroacetic acid-containing mobile phases. J Chromatogr A. 1995;712(1): 177-90. 17. Kuhlmann FE, Apffel A, Fischer S, Goldberg G, Goodley PC. J Am Soc Mass Spectrom. 1995; 6 (12): 1221-1225. 18. Jones M D, Alden P, Fountain KJ, Aubin A. Waters Application Note 720003721EN. 2010.
