Marian Twohig1、Andrew Aubin1、Michael O’Leary1、Tom DePhillipo2、Sherry C. Perine3和David R. Stubbs3

1沃特世公司（美國馬薩諸塞州米爾福德）

2沃特世公司（美國特拉華州紐卡斯?fàn)枺?p>3先正達(dá)作物保護(hù)公司（美國北卡羅來納州格林斯伯勒）

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應(yīng)用優(yōu)勢

■與正相分離相比，本方案提高了對映體和非對映體之間的分離度，縮短了分析時(shí)間，實(shí)現(xiàn)了更高的樣品通量并減少了溶劑消耗。

■對映體和/或非對映體比率測量的可靠性和可重復(fù)性確保了應(yīng)用正確率。

關(guān)鍵詞

手性農(nóng)藥，UPC2，對映體，非對映體，手性分離，手性拆分，異丙甲草胺，甲霜靈，苯醚甲環(huán)唑。

簡介

因?yàn)閷τ丑w在手性環(huán)境中發(fā)生不同的反應(yīng)，所以開發(fā)手性化合物分離分析方法對于許多研究領(lǐng)域而言都非常重要。生化反應(yīng)可能具有立體或?qū)τ尺x擇性，當(dāng)一種對映體在生化反應(yīng)中產(chǎn)生預(yù)期效應(yīng)（稱為優(yōu)性異構(gòu)體）時(shí)，另一種對映體可能對靶點(diǎn)的效應(yīng)較弱或完全無效。據(jù)估計(jì)，當(dāng)今市場上30%的農(nóng)藥具有光學(xué)異構(gòu)體，并且有報(bào)道指出中國所用的農(nóng)藥有40%為手性農(nóng)藥1,2。對單個(gè)對映體的效應(yīng)的認(rèn)識可能有助于顯著降低農(nóng)藥應(yīng)用總量，因此對映選擇性的研究對農(nóng)用化工制造業(yè)意義重大。為了提高人們對對映選擇性的認(rèn)識，所采用的分析方法需要能夠在短時(shí)間范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)可靠且可重現(xiàn)的分離。超臨界流體色譜(SFC)被認(rèn)為是一種有效的手性分離技術(shù)，與常規(guī)的高效液相色譜(HPLC)相比，它具有許多優(yōu)勢3,4。利用超臨界流體的特性可實(shí)現(xiàn)高效分離并縮短分析時(shí)間。新型農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)越來越復(fù)雜，這意味著在一個(gè)分子中很可能有多個(gè)手性中心5,6,7，需要使用高效的技術(shù)才能成功分離。

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在本應(yīng)用紀(jì)要中，我們展示了三種農(nóng)藥的對映體和/或非對映體分離：甲霜靈-M（苯基酰胺類殺菌劑），S-異丙甲草胺（乙酰苯胺類除草劑）和苯醚甲環(huán)唑（三唑類殺菌劑）。甲霜靈具有一個(gè)手性中心，而異丙甲草胺和苯醚甲環(huán)唑具有兩個(gè)手性中心。它們的結(jié)構(gòu)如圖1至3所示。使用Waters超高效合相色譜系統(tǒng)(UltraPerformance Convergence Chromatography System, UPC2)進(jìn)行分離。合相色譜是針對液相色譜的一種補(bǔ)充性分離技術(shù)，具有正交選擇性，以超臨界CO2作為主要流動相。

實(shí)驗(yàn)

儀器?

本方法使用ACQUITY UPC2系統(tǒng)進(jìn)行分離，單波長光電二極管陣列(PDA)?檢測器。使用Empower?3軟件進(jìn)行色譜數(shù)據(jù)處理。

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樣品制備

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品由先正達(dá)公司提供，與異丙醇共溶備用。

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方法條件

甲霜靈-M

分離模式： ?梯度

色譜柱： ?ChiralpakIA-3

? ? ? ? ? 4.6×150 mm，3 μm

共溶劑： ?異丙醇

ABPR： ?2000 psi/138 bar

流速： ?4.0 mL/min

UV檢測： ?215 nm

柱溫： ?55 ℃

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進(jìn)樣體積： ?1 μL

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苯醚甲環(huán)唑

分離模式： ?等度

色譜柱： ?Chiralcel OD-3

? ? ? ? ? 4.6×150 mm，3 μm

共溶劑： ?異丙醇/1-丁醇（70/30）

ABPR： ?2000 psi/138 bar

流速： ?2.0 mL/min

UV檢測： ?235 nm

柱溫： ?35 ?℃

進(jìn)樣體積： ?2 μL

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S-異丙甲草胺

分離模式： ?梯度

色譜柱： ?Chiralpak IA-3

? ? ? ? ? 4.6×150 mm，3 μm

共溶劑： ?異丙醇

ABPR： ?2000 psi/138 bar

流速： ?2.5 mL/min

UV檢測： ?220 nm

柱溫： ?35 ℃

進(jìn)樣體積： ?2 μL

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結(jié)果與討論

在通用篩選梯度條件下，采用多種手性柱和共溶劑開始對農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行方法開發(fā)。采用這種技術(shù)可縮短分析時(shí)間，從而可快速完成篩選步驟。然后對共溶劑和色譜柱的組合進(jìn)行優(yōu)化，以使每種化合物實(shí)現(xiàn)最佳分離。手性分離的選擇性隨不同的溫度、壓力和流速而顯著改變8。我們還對梯度和等度分離進(jìn)行了評估；二者均能使各種化合物的立體異構(gòu)體得到成功分離。 此處報(bào)告的分離顯示出最佳分離度（Rs）。甲霜靈的外消旋混合物標(biāo)準(zhǔn)品和具有生物活性的R-對映體9甲霜靈-M的優(yōu)化分離如圖4所示。

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S和R對映體之間的Rs為2.64（表1）。在2009年發(fā)表的一篇文獻(xiàn)中報(bào)道了一種采用己烷/乙醇（60/40）進(jìn)行甲霜靈對映體分離的正相等度方法，該文獻(xiàn)中對手性農(nóng)藥的對映選擇性分離進(jìn)行了全面研究。據(jù)報(bào)道，在不到15 min的時(shí)間內(nèi)洗脫的兩種對映體的Rs為1.9410,11。

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據(jù)報(bào)道，異丙甲草胺中95%的除草活性來自S型對映體12,13。異丙甲草胺的所有四種立體異構(gòu)體的分離如圖5所示，峰3和4之間出現(xiàn)最Rs值1.62（表1）。2009年發(fā)表的文章中還報(bào)道稱，采用正相分離技術(shù)和己烷/二乙醚（91/9）可實(shí)現(xiàn)異丙甲草胺立體異構(gòu)體的基線分離。該文章中的譜圖顯示所有四種立體異構(gòu)體在20-30 min之間洗脫10,14。本文所報(bào)道的ACQUITY UPC2方法可顯著縮短甲霜靈和異丙甲草胺的分析時(shí)間。此外，無需使用有潛在危險(xiǎn)的溶劑。

苯醚甲環(huán)唑外消旋混合物的立體異構(gòu)體分離如圖6所示。峰2和3之間出現(xiàn)最Rs值1.5。在前文提及的文章中報(bào)道了采用己烷/乙醇（90/10）對苯醚甲環(huán)唑的立體異構(gòu)體進(jìn)行正相分離，四種立體異構(gòu)體在30-55 min之間發(fā)生分離。按照所報(bào)道的方法，峰1，2或峰2，3之間未達(dá)到基線分離（Rs>1.5）10,15。

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經(jīng)優(yōu)化的ACQUITY UPC2方法可增加樣品通量，并提高對映體和非對映體的分離度。對于甲霜靈-M，兩種對映體在1 min內(nèi)洗脫（圖4）；S-異丙甲草胺的所有四種立體異構(gòu)體在4.5 min內(nèi)洗脫（圖5）。采用等度洗脫，四種苯醚甲環(huán)唑立體異構(gòu)體在8 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)分離（圖6），比文獻(xiàn)中報(bào)道的某些正相方法快6倍。各種化合物的所有立體異構(gòu)體的保留時(shí)間、峰面積、峰面積%和峰高的重現(xiàn)性數(shù)據(jù)（n=6）的RSD%低于或等于1.22（表2-4）。

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結(jié)論

在本應(yīng)用紀(jì)要中，我們展示了利用ACQUITY UPC2進(jìn)行的手性農(nóng)藥分析。與傳統(tǒng)的正相分離相比，ACQUITY UPC2可實(shí)現(xiàn)高效分離，能夠顯著增加樣品通量10，縮短了從色譜柱和共溶劑的篩選階段到形成最終優(yōu)化方法所需的方法開發(fā)時(shí)間。本文中介紹的方法使用超臨界CO2作為主要流動相，異丙醇作為主要的有機(jī)改性劑。對于使用大量具有潛在危險(xiǎn)的溶劑的需求降低，從而削減了與溶劑棄置處理相關(guān)的成本。所得的RSD%與利用UPLC/UV方法所得的RSD%相當(dāng)。一直以來，由于在分離手性化合物方面存在困難，使得對于對映選擇性毒性和環(huán)境的研究面臨著嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。 現(xiàn)在，我們可以通過更快速的分析方法來分離手性化合物，這也意味著我們能更迅速地獲得有關(guān)立體選擇性行為的關(guān)鍵信息。

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