Hongwei Xie, Weibin Chen, Martin Gilar, St John Skilton, and Jeffery R. Mazzeo
Waters Corporation, Milford, MA, U.S.

前言
??????? 流感是一種呼吸道病毒感染，它是美國主要的致死原因之一，每年有超過50,000人死于流感1。流感疫苗是一種主要的流感預(yù)防措施，也是降低季節(jié)性流感發(fā)病率和死亡率的主要策略。疫苗通過結(jié)合病毒血凝素（HA）抗體為人體提供保護(hù)，血凝素在流感感染中起到關(guān)鍵的作用。
?????? ?經(jīng)批準(zhǔn)的季節(jié)性流感滅活疫苗通常含有規(guī)定量的HAs——H1、H3和B的混合物，對應(yīng)3種最常見的病毒流感A亞型的H1N1和H3N2和流感B的HA蛋白。這些HA蛋白是糖蛋白類，每個(gè)糖基化位點(diǎn)均含有多種N-糖基化基序且每個(gè)位點(diǎn)含多種糖形。由于HAs在流感結(jié)合至宿主細(xì)胞，即感染過程中的重要決定作用，HAs中糖基化的精細(xì)鑒定和監(jiān)測對疫苗的開發(fā)和生產(chǎn)都非常重要。
????? ? 目前，N-糖基化鑒定方法包括釋放的游離聚糖分析2-4和完整質(zhì)量分析5-7。這些方法對于分析含確定糖基化位點(diǎn)的糖蛋白類是有效的，如單克隆抗體。聚糖譜分析可在完整蛋白水平（完整質(zhì)量分析）或作為碳水化合物（游離聚糖譜）進(jìn)行。由于糖基化的天冬酰胺（N）殘基的質(zhì)量在去糖基化時(shí)增加了1 Da，糖基化位點(diǎn)通?？捎山?jīng)酶（通常是PNGase F）去除聚糖部分后的肽譜來檢測。?
??????? 然而，這些方法很難區(qū)分同一蛋白不同糖基化位點(diǎn)上的聚糖分子，因此用這些方法表征含多個(gè)糖基化位點(diǎn)的糖蛋白，如HAs，是極富挑戰(zhàn)的。而且，如疫苗等復(fù)雜樣品均含有帶-NXS/T-基序的多個(gè)N糖基化位點(diǎn)。由于N位點(diǎn)修飾后1Da 質(zhì)量增加可能是由其他位點(diǎn)糖基化或脫酰胺作用造成，通過肽譜確定N-鏈糖基化位點(diǎn)是非常困難的。
?????? 采用UPLC?革新的分離能力，經(jīng)由LC/UV-MS系統(tǒng)分析了單克隆鼠lgG1抗體胰蛋白酶消化所得胰蛋白酶肽的四種主要的N-糖形9。結(jié)果顯示該方法可檢測并量化糖基化。且采用該方法可同時(shí)鑒定糖基化位點(diǎn)和聚糖分子。
?????? 在以前的研究中10-11，我們證實(shí)采用UPLC/MSE獲得的胰蛋白酶肽譜能夠準(zhǔn)確的分離和鑒定位點(diǎn)特異性修飾，如N-去氨酰作用和M-氧化。
?????? 在本應(yīng)用實(shí)例中，我們證明UPLC/MSE可區(qū)分離并鑒定由昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒重組表達(dá)系統(tǒng)（BEVS）表達(dá)的流感疫苗候選物HAs蛋白的N-糖基化。糖肽和糖形可由ACQUITY UPLC?系統(tǒng)在多肽水平分離，并由SYNAPT? MS系統(tǒng)在線檢測。UPLC/MSE數(shù)據(jù)經(jīng)BiopharmaLynx? 軟件處理并報(bào)告N-糖基化信息。該方法改進(jìn)了表征質(zhì)量并減少數(shù)據(jù)處理時(shí)間。此外，該方案有一個(gè)為非專業(yè)研究者提供了解決這類問題的通用流程，工作流程化可使整個(gè)團(tuán)隊(duì)受益。

實(shí)驗(yàn)
由昆蟲細(xì)胞BEVS系統(tǒng)表達(dá)的含有HA蛋白H1，H3和B的流感疫苗候選物經(jīng)胰蛋白酶消化。肽段混合物含有N-糖肽及來自于目的蛋白的其它肽段。制備的過程包括：
1. 蛋白溶解于0.05% RapiGest? SF、pH 7.4的溶液中，80 °C 加熱10 min變性
2. 56°C，DDT還原30 min
3. 黑暗，室溫下采用碘乙酰胺烷基化30 min
4. 37 °C，pH 7.4下，胰蛋白酶消化4 hrs
5. 加入0.1%甲酸終止反應(yīng)，并滅活胰蛋白酶。
????? ?消化產(chǎn)物經(jīng)汗0.1%甲酸的5%乙腈（ACN）溶液稀釋成0.2 μg/μL，用于UPLC/MS分析。
?????? UPLC/MSE實(shí)驗(yàn)采用ACQUITY UPLC-SYNAPT質(zhì)譜偶聯(lián)系統(tǒng)分析。UPLC系統(tǒng)配置2.1 x 150 mm、BEH300 C18 1.7-μm肽分離柱。取20-μL含約4 μg肽混合物進(jìn)樣，采用120-min 梯度洗脫（1至40% ACN0.1% FA溶液），流速0.2 mL/min，柱溫60 °C。重復(fù)進(jìn)樣四次。
?????? 采用ESI陽離子模式獲得MSE 數(shù)據(jù)，低碰撞能（5 V）采集肽前體（MS）數(shù)據(jù)和提高能量（20-40V之間調(diào)整）獲得肽片段（MSE）數(shù)據(jù)。掃描時(shí)間為0.5秒（總工作周期1 sec）。分析中各種參數(shù)為：柱壓3.0 kV，源溫度100 °C，錐孔電壓 37 V，且錐孔氣流10 L/h。該系統(tǒng)調(diào)至最低分辨率10,000（V-模式），并采用100 fmol/μL Glu1-fibrinopeptide B（GFP）校正, GFP由含0.1% FA 50:50 ACN/水溶液配制，通過LOCKSPRAY通道每分鐘進(jìn)樣一次以確保高質(zhì)量準(zhǔn)確度。?
?????? 采集的數(shù)據(jù)經(jīng)BiopharmaLynx, v. 1.2，MassLynx? 軟件的應(yīng)用管理程序進(jìn)行處理，采用strict tryptic cleavage rule，且設(shè)置cysteine carbamidomethylation為固定修飾，以及N-糖基化作為可變修飾。其它BiopharmaLynx 方法設(shè)置參照我們以前發(fā)表的文章。12

結(jié)果和討論
?????? 據(jù)報(bào)道，昆蟲細(xì)胞系表達(dá)的糖蛋白具有兩種主要的N-聚糖類型：少甘露糖苷結(jié)構(gòu)（Man (1-3) GlcNAc2 or Man (1-3) GlcNAc[Fuc]GlcNAc）和寡聚甘露糖結(jié)構(gòu)（Man(5-9)GlcNAc2），這里Man表示甘露糖，GlcNAc為N-乙酰葡糖胺，而Fuc是海藻糖。BiopharmaLynx含有11種可能的可變N-糖基化修飾糖形。HA 蛋白H1、H3和B的可能的N-糖基化位點(diǎn)（含-NXS/T基序）數(shù)目分別為9、12和10。對采集的UPLC/MSE數(shù)據(jù)經(jīng)BiopharmaLynx處理后，可分別判定H1、H3和B 7、4和6個(gè)N_糖基化位點(diǎn)。每個(gè)N_糖基化位點(diǎn)可能有多種連接的糖形。以下我們挑選出3個(gè)典型樣品（其中一個(gè)來自于疫苗樣本中的HA蛋白），以闡釋UPLC/MSE 是如何用于分離和表征糖肽和糖形。?
?????? 圖1顯示了HA蛋白B中糖基化和未糖基化的胰蛋白肽T8（分別命名為B_T8*和B_T8，在后面的文章中，所有的糖基化肽均采用型號(hào)（*）標(biāo)記以表明相應(yīng)的修飾形式）的分離和鑒定。
?????? 由于添加的糖基團(tuán)增加了親水性，B_T8*洗脫較B_T8早（圖1A）。胰蛋白酶肽序列由MSE譜確定（圖1B和1C）。?
?????? B_T8*的糖基化由一系列低m/z 范圍的特征糖離子m/z 138.05，m/z 204.09，m/z 366.14和m/z 528.12展示，并由y28離子確證。y28糖基化修飾前后1038.36的質(zhì)量變化與一種聚糖分子質(zhì)量相對應(yīng)（-Man3NAcGlc[Fuc]NAcGlc）。高m/z 范圍的糖基碎片離子可以給出所連接聚糖分子的進(jìn)一步結(jié)構(gòu)信息?；贐iopharmaLynx的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度和前體物質(zhì)的提取離子流色譜面積，B_T8*的相對濃度為 20%。

圖1. HA蛋白B 中糖基化和未糖基化胰蛋白酶肽段 T8的分離和鑒定

A) 前體的提取離子色譜
B) B_T8（未指定離子m/z 1199.65 和m/z 1023.5為在疫苗制劑的過程中加入的Twin-20碎片）的MSE譜
C) B_T8*MSE 譜

??????? 與B_T8*不同，大多數(shù)已經(jīng)鑒定的糖肽類是由多種糖形完全糖基化的，如HA蛋白H1肽段T24，未檢測出未修飾的H1_T24，但H1_T24*的四種修飾糖形經(jīng)層析法獲得分離和鑒定（圖 2A）。糖形的洗脫順序與聚糖的大小有關(guān)。聚糖越重，這種聚糖形的糖基化肽洗脫越早。該肽含有兩個(gè)N位點(diǎn)，但MSE 譜確定糖基化僅發(fā)生在含有-NSS-基序的N286，而含有-NVH-基序的N293則無糖基化修飾。這一現(xiàn)象與N-糖基化僅發(fā)生在含有-NXS/T-基序的N位點(diǎn)的定律一致。圖2B中顯示了H1_T24*-Man3NAcGlc2的MSE譜。同樣的，低m/z范圍的特征糖離子和高m/z范圍的糖基碎片離子進(jìn)一步確認(rèn)了糖基化并提供了聚糖分子的結(jié)構(gòu)信息。?

圖2. HA蛋白H1中糖肽T24*的糖形的分離與鑒定
A) 前體的提取離子色譜
B) H1_T24*-Man3NAcGlc2 MSE 譜
# –特征糖離子?

?

??????? 然而，并非所有已鑒定的糖形均可用層析法分離，如HA蛋白H3的胰蛋白酶肽T21中經(jīng)鑒定的5種糖形（見圖3A），但這些糖形在91.65 min 的同一個(gè)LC峰被洗脫。它們在提取離子色譜的保留時(shí)間僅有微小差異（~ 2秒）（數(shù)據(jù)未顯示）。這些證據(jù)和上述的例子表明糖形的色譜行為與聚糖連接的肽序列的性質(zhì)有關(guān)。H3_T21的肽段序列和糖基化可由MSE 譜確定。圖3B中展示了一個(gè)H3_T21*-Man9NAcGlc2 MSE譜的例子。

圖3. HA蛋白H3中糖肽T21*糖形的分離和鑒定.
A） MS譜
B） H3_T21*-Man9NAcGlc2.的MSE譜
# – 特征糖離子

討論
??????? 本文的數(shù)據(jù)表明UPLC/MSE 可分離并鑒定流感疫苗樣品血凝素糖蛋白中多個(gè)糖肽及多種糖形。由于HA 蛋白有多個(gè)糖基化位點(diǎn)和多種糖形，傳統(tǒng)的方法如聚糖分析和完整質(zhì)量分析很難勝任流感疫苗樣本糖基化的鑒定。
?????? 與傳統(tǒng)的糖基化鑒定方法不同，本研究中糖基化位點(diǎn)已采用MSE技術(shù)清晰的進(jìn)行鑒定。MSE中的糖碎片離子的聚糖分子提供了有用的結(jié)構(gòu)信息。此外，這些方法無需任何額外的富集或純化流程，獲得的數(shù)據(jù)可由BiopharmaLynx自動(dòng)進(jìn)行處理。
?????? 進(jìn)一步的優(yōu)化可使得該方法不僅適用于復(fù)雜樣品，如流感疫苗的糖基化的鑒定，也可作為一種鑒定糖蛋白的快速和常規(guī)方法。

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