91儀器信息網(wǎng)訊 2月19日（美國(guó)時(shí)間），美國(guó)衛(wèi)生總署(NIH)與美國(guó)得克薩斯大學(xué)奧斯汀分校Jason S. McLellan研究組首次利用冷凍電鏡解析新冠病毒刺突蛋白分子結(jié)構(gòu)的成果在《Science》上發(fā)表，該研究已于2月15日發(fā)表在預(yù)印本網(wǎng)站bioRxiv，并快速通過(guò)同行審議發(fā)表于《Science》期刊。該成果將對(duì)開(kāi)發(fā)新冠疫苗提供幫助。

▊ 研究背景

此前多項(xiàng)研究從不同角度證實(shí)，新冠狀病毒（2019-nCoV）感染人體細(xì)胞的方式與SARS-CoV類(lèi)似：利用刺突蛋白（S蛋白）與ACE2受體作用來(lái)感染人體細(xì)胞，即新冠病毒的S蛋白結(jié)合人體ACE2受體。

于是，S蛋白和ACE2受體成為研究的兩大關(guān)鍵目標(biāo)，本次《Science》成果正是利用冷凍電鏡技術(shù)解析了S 蛋白三維結(jié)構(gòu)；而同一天（19日）西湖大學(xué)周強(qiáng)團(tuán)隊(duì)預(yù)印版平臺(tái)bioRxiv發(fā)表成果則是利用冷凍電鏡技術(shù)解析了人ACE2受體三維結(jié)構(gòu)。

什么是S蛋白？

刺突蛋白（S蛋白）是疫苗開(kāi)發(fā)、治療性抗體和診斷方法的關(guān)鍵目標(biāo)。根據(jù)S 蛋白的蛋白結(jié)構(gòu)功能可以將其分成兩個(gè)功能單位：S1和S2蛋白亞基。S1能夠促進(jìn)病毒結(jié)合到宿主細(xì)胞受體的能力，其含有一個(gè)重要的C端受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RBD），正是這個(gè)位置負(fù)責(zé)和受體結(jié)合。

什么是ACE2受體？

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）是SARS冠狀病毒（SARS-CoV）的表面受體，與S蛋白直接相互作用。 ACE2也被認(rèn)為是新冠狀病毒（2019-nCoV）的受體，表現(xiàn)為嚴(yán)重的呼吸綜合征。ACE2主要生理作用是促進(jìn)血管緊張素的成熟，在肺、心臟、腎臟和腸道廣泛存在。但當(dāng)病毒入侵時(shí)，ACE2就被病毒“綁架”了。

西湖大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)稱(chēng)：“在SARS病毒和‘新冠病毒’侵入人體的過(guò)程中，ACE2就像是‘門(mén)把手’，病毒抓住它，從而打開(kāi)了進(jìn)入細(xì)胞的大門(mén)?！?/p>

▊ 研究要點(diǎn)

1）新冠狀病毒的S蛋白結(jié)構(gòu)是疫苗應(yīng)對(duì)的關(guān)鍵區(qū)域

預(yù)融合構(gòu)象中的2019-nCoV S的結(jié)構(gòu)：（A）2019-nCoV S一級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖，按域著色；（B）具有向上構(gòu)象的單個(gè)RBD的2019-nCoV S蛋白的預(yù)融合結(jié)構(gòu)的側(cè)視圖和俯視圖。

2019-nCoV利用密集的S蛋白進(jìn)入宿主細(xì)胞。S蛋白是一種三聚體I類(lèi)融合蛋白，存在于亞穩(wěn)態(tài)的預(yù)融合構(gòu)象中，該構(gòu)象經(jīng)過(guò)劇烈的結(jié)構(gòu)重排以使病毒膜與宿主細(xì)胞膜融合。當(dāng)S1亞基與宿主細(xì)胞受體結(jié)合時(shí)，觸發(fā)該過(guò)程。受體結(jié)合會(huì)破壞融合前三聚體的穩(wěn)定性，導(dǎo)致S1亞基脫落，并使S2亞基轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的融合后構(gòu)象。為了與宿主細(xì)胞受體接合，S1的受體結(jié)合域（RBD）經(jīng)歷了鉸鏈狀構(gòu)象運(yùn)動(dòng)，該構(gòu)象運(yùn)動(dòng)暫時(shí)隱藏或暴露了受體結(jié)合的決定因素。這兩個(gè)狀態(tài)分別稱(chēng)為“向下”構(gòu)象和“向上”構(gòu)象，其中向下對(duì)應(yīng)于受體不可及的狀態(tài)，向上對(duì)應(yīng)于受體可及的狀態(tài)，受體結(jié)合狀態(tài)不太穩(wěn)定，是抗體介入的較好目標(biāo)。因此，預(yù)融合S蛋白結(jié)構(gòu)的表征將提供原子水平的信息，并指導(dǎo)疫苗的設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)。

 2）2019-nCoV具有與冠狀病毒科相同的觸發(fā)機(jī)制

2019-nCoV S蛋白的表達(dá)與純化

研究組制備獲得了約0.5 mg / L的重組前融合穩(wěn)定Sectodomain，并通過(guò)親和層析和尺寸排阻層析將蛋白質(zhì)純化至均質(zhì)（上圖）。使用這種純化的、完全糖基化的S蛋白進(jìn)行冷凍電鏡表征。

收集并處理了3207張顯微照片后，獲得了一個(gè)3.5 埃分辨率的非對(duì)稱(chēng)三聚體的三維重構(gòu)圖像，其中一個(gè)RBD在此構(gòu)象中被觀察到。通過(guò)在cryoSPARC v2中使用3D可變性功能，我們觀察到RBD經(jīng)歷了鉸鏈狀運(yùn)動(dòng)時(shí)S1亞基的呼吸（見(jiàn)以下視頻），這可能是導(dǎo)致S1的局部分辨率較差（與穩(wěn)定的S2亞基相比）。這種看似隨機(jī)的RBD運(yùn)動(dòng)已在密切相關(guān)的 冠狀病毒SARS-CoV和MERS-CoV以及更遠(yuǎn)相關(guān)的 冠狀病毒豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的結(jié)構(gòu)表征中捕獲。在2019-nCoV S中對(duì)該現(xiàn)象的觀察表明，它具有與冠狀病毒科相同的觸發(fā)機(jī)制，其中受體與暴露的RBD結(jié)合導(dǎo)致不穩(wěn)定的3 RBD-up構(gòu)象，并導(dǎo)致脫落S1和S2的重新折疊。

從側(cè)面沿著病毒膜看2019-nCoV S三聚體

從頂部朝病毒膜方向看2019-nCoV S三聚體

因?yàn)镾2亞基是一個(gè)對(duì)稱(chēng)的三聚體，研究者對(duì)其進(jìn)行了3D優(yōu)化，增加了C3的對(duì)稱(chēng)性，得到了一個(gè)3.2 埃分辨率的圖，S2亞基的密度非常好。利用這兩種圖譜，構(gòu)建了大部分2019-nCoV S胞外域，包括每個(gè)三聚體的66個(gè)N聯(lián)糖基化位點(diǎn)中的44個(gè)的聚糖(見(jiàn)下圖)。

冷凍電鏡圖和N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)：（A）經(jīng)C3處理的2019-nCoV S的未銳化低溫EM密度圖的不對(duì)稱(chēng)單位顯示為透明分子表面

3）2019-nCoV的S蛋白與ACE2受體親和力高于SARS-CoV：更易人傳人？

2019-nCoV S以高親和力結(jié)合人ACE2

最近的報(bào)道表明2019-nCoV S和SARS-CoV S具有相同的功能宿主細(xì)胞受體-血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2 (ACE2)，這促使研究者通過(guò)表面等離子體共振(SPR)來(lái)量化這種相互作用的動(dòng)力學(xué)。ACE2與2019-nCoV S外域結(jié)合，其親和力約為15 nM，比ACE2與SARS-CoV S結(jié)合的親和力高出10- 20倍(上圖A)。研究者還制備了與2019-nCoV S胞外域結(jié)合的ACE2的復(fù)合物，并通過(guò)負(fù)染色電鏡技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了觀察，冷凍電鏡高分辨觀察發(fā)現(xiàn)（上圖B），它與SARS-CoV S和ACE2之間形成的復(fù)合物非常相似。表明2019-nCoV S對(duì)人ACE2的高親和力可能有助于使2019-nCoV S在人與人之間傳播變得明顯容易，但還需要更多研究來(lái)研究這種可能性。

4）針對(duì)SARS-CoV的多克隆抗體不能與2019-nCoV結(jié)合

基于SARS-CoV和2019-nCoV之間的整體結(jié)構(gòu)同源性和共同的受體，研究者測(cè)試了已發(fā)表的3種針對(duì)SARS-CoV RBD區(qū)域的多克隆抗體（S230、m396和80R），對(duì)其交叉反應(yīng)性進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示此3種抗體在新冠病毒中完全沒(méi)有結(jié)合力。表明針對(duì)SARS-CoV的多克隆抗體對(duì)于2019-nCoV不一定奏效。

▋小結(jié)

了解2019-nCoVS蛋白原子水平結(jié)構(gòu)將有助于進(jìn)一步的蛋白質(zhì)工程研究，以改善抗原性和蛋白質(zhì)表達(dá)，從而助力疫苗開(kāi)發(fā)。這些結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)也有助于評(píng)估2019-nCoV突變，該突變將隨著病毒的遺傳漂移而發(fā)生；并有助于確定這些殘基是否有表面暴露，并映射到其他冠狀病毒突變蛋白的已知抗體表位。此外，原子水平的細(xì)節(jié)將使設(shè)計(jì)和篩選具有熔合抑制潛力的小分子成為可能。這些信息將為精確疫苗設(shè)計(jì)和抗病毒治療的發(fā)現(xiàn)提供支持，從而加速醫(yī)學(xué)對(duì)策的發(fā)展。

McLellan在接受新華社記者采訪(fǎng)時(shí)表示，他們已將這一結(jié)構(gòu)的原子坐標(biāo)數(shù)據(jù)發(fā)送給全球多家實(shí)驗(yàn)室，其中多數(shù)來(lái)自中國(guó)，目前已有大約25家中國(guó)實(shí)驗(yàn)室要求獲取相關(guān)資料。

并表示，這一成果可幫助研究人員展開(kāi)三個(gè)方面的工作。第一，展開(kāi)潛在藥物篩查，發(fā)現(xiàn)可與這種刺突蛋白結(jié)合并破壞其功能的小分子；第二，設(shè)計(jì)可以與刺突蛋白結(jié)合并抑制其功能的新型蛋白分子或抗體；第三，設(shè)計(jì)出這種刺突蛋白的變體，例如使其擁有更高表達(dá)水平或熱穩(wěn)定性，從而誘發(fā)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，以加快疫苗開(kāi)發(fā)。

附：研究中應(yīng)用到的部分主要儀器設(shè)備

冷凍電鏡：配置K3相機(jī)（Gatan）的Titan Krios（Thermo Fisher）

透射電鏡：配置Ceta 16M相機(jī)的FEI Talos TEM（Thermo Fisher）

冷凍制樣設(shè)備：Vitrobot Mark IV（Thermo Fisher）

生物大分子相互作用分析儀：Biacore X100（GE Healthcare）

色譜柱：Superose 6 10/300（GE Healthcare）

等離子清洗儀：Solarus 950（Gatan）