91儀器信息網(wǎng)訊 2月19日（美國時間），美國衛(wèi)生總署(NIH)與美國得克薩斯大學奧斯汀分校Jason S. McLellan研究組首次利用冷凍電鏡解析新冠病毒刺突蛋白分子結(jié)構(gòu)的成果在《Science》上發(fā)表，該研究已于2月15日發(fā)表在預印本網(wǎng)站bioRxiv，并快速通過同行審議發(fā)表于《Science》期刊。該成果將對開發(fā)新冠疫苗提供幫助。

▊ 研究背景

此前多項研究從不同角度證實，新冠狀病毒（2019-nCoV）感染人體細胞的方式與SARS-CoV類似：利用刺突蛋白（S蛋白）與ACE2受體作用來感染人體細胞，即新冠病毒的S蛋白結(jié)合人體ACE2受體。

于是，S蛋白和ACE2受體成為研究的兩大關(guān)鍵目標，本次《Science》成果正是利用冷凍電鏡技術(shù)解析了S 蛋白三維結(jié)構(gòu)；而同一天（19日）西湖大學周強團隊預印版平臺bioRxiv發(fā)表成果則是利用冷凍電鏡技術(shù)解析了人ACE2受體三維結(jié)構(gòu)。

什么是S蛋白？

刺突蛋白（S蛋白）是疫苗開發(fā)、治療性抗體和診斷方法的關(guān)鍵目標。根據(jù)S 蛋白的蛋白結(jié)構(gòu)功能可以將其分成兩個功能單位：S1和S2蛋白亞基。S1能夠促進病毒結(jié)合到宿主細胞受體的能力，其含有一個重要的C端受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RBD），正是這個位置負責和受體結(jié)合。

什么是ACE2受體？

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）是SARS冠狀病毒（SARS-CoV）的表面受體，與S蛋白直接相互作用。 ACE2也被認為是新冠狀病毒（2019-nCoV）的受體，表現(xiàn)為嚴重的呼吸綜合征。ACE2主要生理作用是促進血管緊張素的成熟，在肺、心臟、腎臟和腸道廣泛存在。但當病毒入侵時，ACE2就被病毒“綁架”了。

西湖大學研究團隊稱：“在SARS病毒和‘新冠病毒’侵入人體的過程中，ACE2就像是‘門把手’，病毒抓住它，從而打開了進入細胞的大門。”

▊ 研究要點

1）新冠狀病毒的S蛋白結(jié)構(gòu)是疫苗應對的關(guān)鍵區(qū)域

預融合構(gòu)象中的2019-nCoV S的結(jié)構(gòu)：（A）2019-nCoV S一級結(jié)構(gòu)示意圖，按域著色；（B）具有向上構(gòu)象的單個RBD的2019-nCoV S蛋白的預融合結(jié)構(gòu)的側(cè)視圖和俯視圖。

2019-nCoV利用密集的S蛋白進入宿主細胞。S蛋白是一種三聚體I類融合蛋白，存在于亞穩(wěn)態(tài)的預融合構(gòu)象中，該構(gòu)象經(jīng)過劇烈的結(jié)構(gòu)重排以使病毒膜與宿主細胞膜融合。當S1亞基與宿主細胞受體結(jié)合時，觸發(fā)該過程。受體結(jié)合會破壞融合前三聚體的穩(wěn)定性，導致S1亞基脫落，并使S2亞基轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的融合后構(gòu)象。為了與宿主細胞受體接合，S1的受體結(jié)合域（RBD）經(jīng)歷了鉸鏈狀構(gòu)象運動，該構(gòu)象運動暫時隱藏或暴露了受體結(jié)合的決定因素。這兩個狀態(tài)分別稱為“向下”構(gòu)象和“向上”構(gòu)象，其中向下對應于受體不可及的狀態(tài)，向上對應于受體可及的狀態(tài)，受體結(jié)合狀態(tài)不太穩(wěn)定，是抗體介入的較好目標。因此，預融合S蛋白結(jié)構(gòu)的表征將提供原子水平的信息，并指導疫苗的設計和開發(fā)。

 2）2019-nCoV具有與冠狀病毒科相同的觸發(fā)機制

2019-nCoV S蛋白的表達與純化

研究組制備獲得了約0.5 mg / L的重組前融合穩(wěn)定Sectodomain，并通過親和層析和尺寸排阻層析將蛋白質(zhì)純化至均質(zhì)（上圖）。使用這種純化的、完全糖基化的S蛋白進行冷凍電鏡表征。

收集并處理了3207張顯微照片后，獲得了一個3.5 埃分辨率的非對稱三聚體的三維重構(gòu)圖像，其中一個RBD在此構(gòu)象中被觀察到。通過在cryoSPARC v2中使用3D可變性功能，我們觀察到RBD經(jīng)歷了鉸鏈狀運動時S1亞基的呼吸（見以下視頻），這可能是導致S1的局部分辨率較差（與穩(wěn)定的S2亞基相比）。這種看似隨機的RBD運動已在密切相關(guān)的 冠狀病毒SARS-CoV和MERS-CoV以及更遠相關(guān)的 冠狀病毒豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的結(jié)構(gòu)表征中捕獲。在2019-nCoV S中對該現(xiàn)象的觀察表明，它具有與冠狀病毒科相同的觸發(fā)機制，其中受體與暴露的RBD結(jié)合導致不穩(wěn)定的3 RBD-up構(gòu)象，并導致脫落S1和S2的重新折疊。

從側(cè)面沿著病毒膜看2019-nCoV S三聚體

從頂部朝病毒膜方向看2019-nCoV S三聚體

因為S2亞基是一個對稱的三聚體，研究者對其進行了3D優(yōu)化，增加了C3的對稱性，得到了一個3.2 埃分辨率的圖，S2亞基的密度非常好。利用這兩種圖譜，構(gòu)建了大部分2019-nCoV S胞外域，包括每個三聚體的66個N聯(lián)糖基化位點中的44個的聚糖(見下圖)。

冷凍電鏡圖和N-聯(lián)糖基化位點：（A）經(jīng)C3處理的2019-nCoV S的未銳化低溫EM密度圖的不對稱單位顯示為透明分子表面

3）2019-nCoV的S蛋白與ACE2受體親和力高于SARS-CoV：更易人傳人？

2019-nCoV S以高親和力結(jié)合人ACE2

最近的報道表明2019-nCoV S和SARS-CoV S具有相同的功能宿主細胞受體-血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2 (ACE2)，這促使研究者通過表面等離子體共振(SPR)來量化這種相互作用的動力學。ACE2與2019-nCoV S外域結(jié)合，其親和力約為15 nM，比ACE2與SARS-CoV S結(jié)合的親和力高出10- 20倍(上圖A)。研究者還制備了與2019-nCoV S胞外域結(jié)合的ACE2的復合物，并通過負染色電鏡技術(shù)對其進行了觀察，冷凍電鏡高分辨觀察發(fā)現(xiàn)（上圖B），它與SARS-CoV S和ACE2之間形成的復合物非常相似。表明2019-nCoV S對人ACE2的高親和力可能有助于使2019-nCoV S在人與人之間傳播變得明顯容易，但還需要更多研究來研究這種可能性。

4）針對SARS-CoV的多克隆抗體不能與2019-nCoV結(jié)合

基于SARS-CoV和2019-nCoV之間的整體結(jié)構(gòu)同源性和共同的受體，研究者測試了已發(fā)表的3種針對SARS-CoV RBD區(qū)域的多克隆抗體（S230、m396和80R），對其交叉反應性進行評估。結(jié)果顯示此3種抗體在新冠病毒中完全沒有結(jié)合力。表明針對SARS-CoV的多克隆抗體對于2019-nCoV不一定奏效。

▋小結(jié)

了解2019-nCoVS蛋白原子水平結(jié)構(gòu)將有助于進一步的蛋白質(zhì)工程研究，以改善抗原性和蛋白質(zhì)表達，從而助力疫苗開發(fā)。這些結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)也有助于評估2019-nCoV突變，該突變將隨著病毒的遺傳漂移而發(fā)生；并有助于確定這些殘基是否有表面暴露，并映射到其他冠狀病毒突變蛋白的已知抗體表位。此外，原子水平的細節(jié)將使設計和篩選具有熔合抑制潛力的小分子成為可能。這些信息將為精確疫苗設計和抗病毒治療的發(fā)現(xiàn)提供支持，從而加速醫(yī)學對策的發(fā)展。

McLellan在接受新華社記者采訪時表示，他們已將這一結(jié)構(gòu)的原子坐標數(shù)據(jù)發(fā)送給全球多家實驗室，其中多數(shù)來自中國，目前已有大約25家中國實驗室要求獲取相關(guān)資料。

并表示，這一成果可幫助研究人員展開三個方面的工作。第一，展開潛在藥物篩查，發(fā)現(xiàn)可與這種刺突蛋白結(jié)合并破壞其功能的小分子；第二，設計可以與刺突蛋白結(jié)合并抑制其功能的新型蛋白分子或抗體；第三，設計出這種刺突蛋白的變體，例如使其擁有更高表達水平或熱穩(wěn)定性，從而誘發(fā)更強的免疫反應，以加快疫苗開發(fā)。

附：研究中應用到的部分主要儀器設備

冷凍電鏡：配置K3相機（Gatan）的Titan Krios（Thermo Fisher）

透射電鏡：配置Ceta 16M相機的FEI Talos TEM（Thermo Fisher）

冷凍制樣設備：Vitrobot Mark IV（Thermo Fisher）

生物大分子相互作用分析儀：Biacore X100（GE Healthcare）

色譜柱：Superose 6 10/300（GE Healthcare）

等離子清洗儀：Solarus 950（Gatan）