T4 DNA連接酶（T4 DNA ligase）

T4 DNA連接酶是ATP依賴的DNA連接酶，催化兩條DNA雙鏈上相鄰的5 磷酸基和3 羥基之間形成磷酸二酯鍵?？蛇B接雙鏈DNA的平末端、互補(bǔ)粘性末端及其中的單鏈切口，也能催化RNA連接到DNA或者雙鏈RNA上，但不催化單鏈核酸的連接。必拓生物采用先進(jìn)技術(shù)研制出高純度、高品質(zhì)的T4 DNA連接酶，媲美TaKaRa、NEB產(chǎn)品。

必拓 T4 DNA連接酶與NEB T4 DNA連接酶對比

選擇酶切過的載體pNET/XcmⅠ（3.3kb，75ng/ l）和片段F3L（500bp，100ng/ l）用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，然后轉(zhuǎn)化*0，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，測定陽性率。

一、T4 DNA連接酶不同用量數(shù)據(jù)對比

分別使用必拓 T4 DNA 連接酶和NEB的T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接，每10 l體系分別加入連接酶0.2 l/0.5 l /1 l，16℃連接30分鐘，連接反應(yīng)體系如下表（每個(gè)連接體系做兩個(gè)平行管）：

連接體系必拓 T4 DNA 連接酶NEBT4 DNA連接酶載體( l)11片段( l)0.680.68連接酶( l)0.2/0.5/10.2/0.5/1buffer( l)2(5X)1(10X)總體積補(bǔ)水至10 l補(bǔ)水至10 l連接片段與載體分子數(shù)比66

16℃連接30分鐘，轉(zhuǎn)化*0感受態(tài)細(xì)胞，復(fù)蘇產(chǎn)物直接取100 l涂板，37℃培養(yǎng)16小時(shí)，菌落計(jì)數(shù)，結(jié)果如下（感受態(tài)效率為2.07 X107）：

酶用量必拓 克隆數(shù)NEB 克隆數(shù) 1 l247317平均282陽性率10/1064 73 平均68.5 陽性率10/100.5 l80139平均109.5-5853平均55.5-0.2 l6883平均75.5-4795平均71-

二、T4 DNA連接酶不同連接時(shí)間數(shù)據(jù)對比

選取酶切過的載體（pNET）與片段（F3L約500bp）分別使用自產(chǎn)T4 DNA 連接酶和NEB的T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接5min、10min、30min，連接產(chǎn)物分別全部轉(zhuǎn)化*0菌株感受態(tài)細(xì)胞，連接反應(yīng)體系如下表（每個(gè)連接體系做兩個(gè)）：

連接體系必拓 T4 DNA 連接酶NEBT4 DNA連接酶載體( l)11片段( l)0.680.68連接酶( l)0.50.5buffer( l)2(5X)1(10X)總體積補(bǔ)水至10 l補(bǔ)水至10 l連接片段與載體分子數(shù)比66

復(fù)蘇產(chǎn)物直接取100 l涂板，37℃培養(yǎng)16小時(shí)，菌落計(jì)數(shù)，結(jié)果如下（感受態(tài)效率為2.07 X107）：

連接時(shí)間必拓 克隆數(shù)NEB 克隆數(shù) 5 min3552平均43.5-21 38 平均29.5 -10 min2625平均25.5-1538平均17.5-30 min3927平均33陽性率10/104036平均38陽性率9/10

T4 DNA連接酶預(yù)混液(Ligation Mixture)

必拓生物經(jīng)優(yōu)化配方后，特別研發(fā)的含有T4 DNA連接酶，及連接反應(yīng)所需各組分的制劑，其中還含有增強(qiáng)連接反應(yīng)的成分，實(shí)驗(yàn)時(shí)只需向DNA溶液中加入T4 DNA連接酶預(yù)混液，即可短時(shí)間內(nèi)方便的將載體和外源片段進(jìn)行連接，反應(yīng)產(chǎn)物可以直接用于轉(zhuǎn)化。

必拓 T4 DNA連接酶預(yù)混液與TaKaRa數(shù)據(jù)對比

反應(yīng)體系1

反應(yīng)1對照1體積PCR產(chǎn)物（1000bp）PCR產(chǎn)物（1000bp）3.5 l(35ng)載體pMD19-T載體pMD19-T0.5 l(40ng)必拓 Ligation MixtureTaKaRa solution I4 l

反應(yīng)條件：16度連接3小時(shí)
轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物：5 l
陽性克隆數(shù)

反應(yīng)克隆數(shù)陽性率有效克隆數(shù)反應(yīng)1127010/101270對照114698/101175

電泳圖1：下排是反應(yīng)1，上排是對照1
 
反應(yīng)體系2

反應(yīng)2對照2體積PCR產(chǎn)物（2000bp）PCR產(chǎn)物（2000bp）4.5 l(35ng)載體pMD19-T載體pMD19-T0.5 l(40ng)必拓 Ligation MixtureTaKaRa solution I5 l

反應(yīng)條件：16度連接3小時(shí)
轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物：5 l
陽性克隆數(shù)

反應(yīng)克隆數(shù)陽性率有效克隆數(shù)反應(yīng)2347510/103475對照251509/104635

電泳圖2：下排是反應(yīng)2，上排是對照2 

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