默克化工技術(shù)（上海）有限公司

研究腫瘤發(fā)病機(jī)制，與腫瘤對(duì)抗，這場(chǎng)戰(zhàn)役已經(jīng)打了好幾個(gè)世紀(jì)了，顯然我們已經(jīng)取得一些進(jìn)展，但我們?nèi)匀粵](méi)有完全攻克，特別是近幾年來(lái)，從多學(xué)科研究，到跨學(xué)科探索，從傳統(tǒng)探索腫瘤發(fā)病機(jī)制到關(guān)于腫瘤轉(zhuǎn)移的新型代表理論“HASINI EFFECT“（哈希妮效應(yīng)），從諸如PD-1/PD-L1/CTLA-4等腫瘤單抗藥如火如荼的研發(fā)和上市，到CAR-T/TCR-T等新型細(xì)胞免疫療法的廣泛立項(xiàng)及申報(bào)到上市，從初期昂貴的新型藥物到來(lái)自社會(huì)普遍關(guān)注下的納入醫(yī)保，在克服腫瘤的路上，我們有理由相信，治愈腫瘤，未來(lái)可期。

兩篇Cancel Cell文章解讀：

Cancer Cell（IF:23.916）

在人乳腺癌中成纖維細(xì)胞異質(zhì)性與免疫抑制環(huán)境

In Brief：

Costa等研究人員確定了四種乳腺癌腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)亞型。CAF-S1促進(jìn)一個(gè)免疫抑制微環(huán)境通過(guò)招募CD4+CD25+ T細(xì)胞分泌CXCL12，促進(jìn)其生長(zhǎng)分化到treg和生存，通過(guò)表達(dá)T細(xì)胞相互作用的蛋白。

乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)4種CAF細(xì)胞亞型

CAF-S1與免疫抑制微環(huán)境顯著相關(guān)

CAF-S1細(xì)胞能通過(guò)表達(dá)OX40L,PD-L2和JAM2招募和保持（CD4+CD25+）T細(xì)胞活性

CAF-S1細(xì)胞能夠通過(guò)B2H7，DPP4和CD73促進(jìn)T淋巴細(xì)胞（CD4+FOXP3+）的增殖

在人乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)存在4種CAF亞型

重新確定了4種CAF亞型的空間分布

CAF-S1在乳腺癌組織中的富集是與FOXP3+T淋巴細(xì)胞的增多緊密關(guān)聯(lián)的

CAF-S1和CAF-S4的分子特征

CAF-S1能夠增強(qiáng)對(duì)CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞的招募和保持

CAF-S1能夠增強(qiáng)Tregs細(xì)胞的分化及活性，然而CAF-S4并沒(méi)有表現(xiàn)出這些屬性

STARMETHOD（超級(jí)ELISA-Milliplex 多因子 panel）

入組樣本篩選（患者平均年齡，診斷/組織學(xué)分級(jí)、病理腫瘤大小、病理在診斷時(shí)確定淋巴結(jié)狀態(tài)、病理轉(zhuǎn)移狀態(tài)、指示BC亞型和腫瘤大小。）該研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)使用了前瞻性隊(duì)列研究（入組樣本均為未經(jīng)任何治療的BC組織和BC癌旁組織，包含Lum和TNBC兩種亞群）和回顧性隊(duì)列研究（主要通過(guò)IHC驗(yàn)證了包含60例和272例的手術(shù)切除組織，該隊(duì)列分析包含了LumA，HER2和TNBC三個(gè)亞群）。

圖1, CAF亞群與細(xì)胞因子的聚類分析，BC細(xì)胞培養(yǎng)上清（n=36）,分析發(fā)現(xiàn)CAF-S1亞群與以上細(xì)胞因子相關(guān)性顯著。

上圖細(xì)胞因子列表為文中所選用的細(xì)胞因子聯(lián)檢試劑盒（25μL樣本同時(shí)檢測(cè)幾十種指標(biāo)）

面臨越來(lái)越多的PD-L1單抗藥的開(kāi)發(fā)與上市，不容忽視的耐藥性問(wèn)題可能正是由于在免疫檢查點(diǎn)中大多數(shù)是PD-1/PD-L1的結(jié)合形式發(fā)生和存在的，PD-L2可能產(chǎn)生的耐藥性問(wèn)題并不明確。相對(duì)傳統(tǒng)的免疫療法，靶向CAF-S1可能是一個(gè)有希望的作為補(bǔ)充治療的新型免疫療法。

參考文獻(xiàn)

1，Ali, H.R., Provenzano, E., Dawson, S.J., Blows, F.M., Liu, B., Shah, M., Earl,H.M., Poole, C.J., Hiller, L., Dunn, J.A., et al. (2014). Association between CD8+ T-cell infiltration and breast cancer survival in 12,439 patients. Ann.Oncol. 25, 1536–1543.

2，Allinen, M., Beroukhim, R., Cai, L., Brennan, C., Lahti-Domenici, J., Huang, H.,Porter, D., Hu, M., Chin, L., Richardson, A., et al. (2004). Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer. Cancer Cell 6, 17–32.

3，Ariga, N., Sato, E., Ohuchi, N., Nagura, H., and Ohtani, H. (2001). Stromal expression of fibroblast activation protein/seprase, a cell membrane serine proteinase and gelatinase, is associated with longer survival in patients with invasive ductal carcinoma of breast. Int. J. Cancer 95, 67–72.

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超級(jí)ELISA   腫瘤免疫治療

最 新研究表明：

經(jīng)CD40配體修飾的CAR-T 細(xì)胞可通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)源性抗腫瘤反應(yīng)來(lái)增強(qiáng)抗腫瘤功能。

嵌合抗原受體(CAR) T細(xì)胞是治療B細(xì)胞惡性腫瘤的有效細(xì)胞。然而,改善 CAR-T細(xì)胞治療仍然需要。在這里，我們?cè)O(shè)計(jì)了腫瘤靶向的CAR-T細(xì)胞，使其具有本構(gòu)性表達(dá)探討免疫刺激分子CD40配體(CD40L)在不同小鼠白血病中的作用淋巴瘤的模型。我們觀察到CD40L+ CAR-T細(xì)胞通過(guò)抗原繞過(guò)腫瘤免疫逃逸通過(guò)CD40/ cd40l介導(dǎo)的細(xì)胞毒性損失和誘導(dǎo)持續(xù)的內(nèi)源性免疫響應(yīng)。過(guò)繼細(xì)胞移植后，CD40L+ CAR-T細(xì)胞表現(xiàn)出較好的抗T活性。

CD40+CAR-T細(xì)胞能夠通過(guò)CD40/CD40L結(jié)合殺傷抗原陰性腫瘤細(xì)胞

CD40+CAR-T細(xì)胞能夠通過(guò)CD40/CD40L結(jié)合殺傷抗原陰性腫瘤細(xì)胞

CD40+CAR-T細(xì)胞相比第二代CAR-T細(xì)胞能夠顯著提升抗腫瘤反應(yīng) 

CD40+CAR-T細(xì)胞激活A(yù)PCs輔助提升抗腫瘤反應(yīng)

激活A(yù)PCs主動(dòng)識(shí)別非CAR-T細(xì)胞來(lái)識(shí)別腫瘤細(xì)胞并增強(qiáng)抗腫瘤反應(yīng)

CD40/CD40L介導(dǎo)細(xì)胞毒性通過(guò)m1928z-CD40L CAR-T細(xì)胞減少抗原陰性腫瘤細(xì)胞增殖

m1928z-CD40L CAR-T細(xì)胞不依賴預(yù)調(diào)節(jié)即可發(fā)揮體內(nèi)有效功能

對(duì)于腫瘤細(xì)胞，相對(duì)于m1928z CAR-T細(xì)胞，m1928z-CD40L CAR-T細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)明顯有所改善

對(duì)于CD40+淋巴細(xì)胞和DC細(xì)胞，CD40L改良型CAR-T細(xì)胞提升共刺激分子表達(dá)上調(diào)

m1928z-CD40L CAR-T細(xì)胞激活體內(nèi)APCs

腫瘤組織和脾 臟中，m1928z-CD40L CAR-T細(xì)胞治療顯著增強(qiáng)了免疫效應(yīng)因子的聚集

m1928z-CD40L CAR-T細(xì)胞通過(guò)CD40/CD40L結(jié)合誘導(dǎo)DCs的激活和增殖

m1928z-CD40L CAR-T細(xì)胞產(chǎn)生更多的體內(nèi)效應(yīng)細(xì)胞因子和增強(qiáng)效應(yīng)功能，相較于內(nèi)源性非CAR-T細(xì)胞

STARMETHOD（超級(jí)ELISA-Milliplex 多因子 panel）

體外分泌細(xì)胞因子分析（MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine, Premixed 13 Plex kit ）：

CAR-T細(xì)胞和A20腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清

CAR-T細(xì)胞和BMDC（IL-12P70誘導(dǎo)的骨 髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞）共培養(yǎng)，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清

血清細(xì)胞因子分析（MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine, Premixed 13 Plex kit ）：

體外B/T細(xì)胞共培養(yǎng)

脾 臟原代分離的野生型B細(xì)胞和反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測(cè)培養(yǎng)上清（Milliplex Mouse TH17 Assay, MTH17MAG-47K）

體外CAR-T細(xì)胞和BMDC共培養(yǎng)

CAR-T細(xì)胞和BMDC（GM-CSF誘導(dǎo)的骨 髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞）共培養(yǎng)，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清（Milliplex Mouse TH17 Assay, MTH17MAG-47K）

圖2 通過(guò)milliplex檢測(cè)A20腫瘤細(xì)胞和經(jīng)CAR-T細(xì)胞治療后的3～7天細(xì)胞因子的變化

上圖細(xì)胞因子列表為文中所選用的細(xì)胞因子聯(lián)檢試劑盒（25μL樣本同時(shí)檢測(cè)幾十種指標(biāo)）

從免疫治療的角度來(lái)看，目標(biāo)是在抗腫瘤過(guò)程中盡可能地增強(qiáng)免疫效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了CD40L+ CAR-T細(xì)胞通過(guò)激活免疫系統(tǒng)的先天和適應(yīng)性分子，以協(xié)調(diào)持續(xù)的內(nèi)源性抗腫瘤反應(yīng)，從而產(chǎn)生更強(qiáng)的抗腫瘤作用。我們相信結(jié)合CAR的高細(xì)胞毒性效應(yīng)，通過(guò)CD40L共刺激分子作用于T細(xì)胞提供激活DCs的策略，招募和增強(qiáng)腫瘤特異性T細(xì)胞和過(guò)繼性CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞毒性。該項(xiàng)研究目前正在測(cè)試 CD40L+ CAR T細(xì)胞在臨床前實(shí)體瘤模型和為臨床下一代抗cd19 CAR T細(xì)胞的制備療法做準(zhǔn)備。

參考文獻(xiàn)

1，Avanzi, M.P., Yeku, O., Li, X., Wijewarnasuriya, D.P., van Leeuwen, D.G.,Cheung, K., Park, H., Purdon, T.J., Daniyan, A.F., Spitzer, M.H., et al. (2018).Engineered tumor-targeted T cells mediate enhanced anti-tumor efficacy both directly and through activation of the endogenous immune system. Cell Rep. 23, 2130–2141.

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3，Barbier, L., Tay, S.S., McGuffog, C., Triccas, J.A., McCaughan, G.W., Bowen,D.G., and Bertolino, P. (2012). Two lymph nodes draining the mouse liver are the preferential site of DC migration and T cell activation. J. Hepatol. 57,352–358.