植物病毒是一類重要病害，幾乎在各類作物上都有發(fā)生，嚴(yán)重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，用一般的方法難以防治，是生產(chǎn)上的一大難題。因而如何對(duì)種子、苗木等無(wú)性繁殖材料進(jìn)行快速檢測(cè)診斷顯得尤為重要。本文主要介紹病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)植物病毒的方法。

目前植物病毒檢測(cè)主要是血清學(xué)檢測(cè)(以病毒外殼蛋白為基礎(chǔ))和核酸檢測(cè)，前者主要包括ELISA、快速免疫濾紙測(cè)定、免疫膠體金技術(shù)、免疫毛細(xì)管區(qū)帶電泳、免疫PCR 等;后者主要有PCR、分子信標(biāo)、實(shí)時(shí)RT-PCR和核酸雜交等。

血清學(xué)檢測(cè)方法

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定是一種采用固相(主要為聚苯乙烯酶聯(lián)板)吸附，將免疫反應(yīng)和酶的高效催化反應(yīng)有機(jī)結(jié)合的方法，其基本原理是以酶催化的顏色反應(yīng)指示抗原抗體的結(jié)合。目前該方法已被廣泛用于植物病毒檢測(cè)。在此基礎(chǔ)上加以改進(jìn)又發(fā)展了一些新的檢測(cè)方法，如A蛋白酶聯(lián)吸附(SPA-ELISA)、斑點(diǎn)免疫吸附(DIBA)、直接組織斑免疫測(cè)定( IDDTB) 、伏安酶聯(lián)免疫分析、快速ELISA 等。

快速免疫濾紙測(cè)定法

快速免疫濾紙測(cè)定類似乳膠凝集反應(yīng)，其原理是把待測(cè)病毒的抗體吸附在乳膠顆粒上，通過(guò)大顆粒乳膠間接反應(yīng)小顆粒病毒的存在。所不同的是RIPA使用了一種紅色乳膠，從而使檢測(cè)更加簡(jiǎn)單和直觀。RIPA目測(cè)檢測(cè)提純TMV 的靈敏度分別可達(dá)5ng/ml～50ng/ml。

免疫膠體金技術(shù)

免疫膠體金技術(shù)最早起源于電鏡方面的研究，由于金在生物學(xué)上是惰性的，且有良好的電荷分布，可以和蛋白質(zhì)(如抗體、A蛋白等)緊密結(jié)合，因此廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和微生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。

免疫毛細(xì)管區(qū)帶電泳

毛細(xì)管區(qū)帶電泳是在裝有一種電解液的空毛細(xì)管兩端加一個(gè)外加電壓。在外加電壓作用下，通過(guò)電泳遷移和電滲流的作用，樣品中的不同組分由于遷移率的不同而分開。免疫毛細(xì)管區(qū)帶電泳將血清學(xué)反應(yīng)專化性和毛細(xì)管區(qū)帶電泳靈敏、快速、可自動(dòng)檢測(cè)的特點(diǎn)結(jié)合起來(lái)，實(shí)時(shí)檢測(cè)抗原- 抗體復(fù)合體Eun等應(yīng)用I-CZE檢測(cè)到10fg建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)班病毒的提純病毒。

免疫PCR 

近年來(lái)出現(xiàn)的免疫PCR是一種將抗原抗體反應(yīng)的高特異性與PCR 的高靈敏度有機(jī)結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)，與酶聯(lián)檢測(cè)技術(shù)相比，免疫PCR是先用抗體來(lái)捕獲抗原，提取核酸后，再用PCR 擴(kuò)增DNA 片段，從而放大抗原抗體反應(yīng)，大大提高了檢測(cè)靈敏度。Sharman建立的復(fù)合免疫PCR ，可同時(shí)檢測(cè)香蕉和車前草粗提液中的香蕉苞葉花葉病毒、黃瓜花葉病毒和香蕉束頂病毒。

以病毒核酸為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

用PCR 檢測(cè)植物病毒所需時(shí)間短，靈敏度特別高。用RT2PCR 檢測(cè)蘋果褪綠葉斑病毒和蘋果莖溝病毒的靈敏度可達(dá)5pg。近年來(lái)，在此基礎(chǔ)上又發(fā)展了多種方法用于植物病毒檢測(cè)。 

分子信標(biāo)(Molecular beacon) 

分子信標(biāo)是具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的一段單鏈核酸分子，5′- 端和3′- 端序列互補(bǔ)形成“莖”，與目標(biāo)序列互補(bǔ)的探針序列為“環(huán)”，在5′- 端連接熒光組分，3′- 端連接猝滅組分。

TaqMan實(shí)時(shí)定量PCR

TaqMan實(shí)時(shí)定量PCR是將RT-PCR和熒光檢測(cè)相結(jié)合，利用TaqDNA聚合酶的5′-端核酸酶活性來(lái)切割在擴(kuò)增過(guò)程中與目標(biāo)序列退火的熒光探針。探針5′- 端連接熒光組分，3′- 端連接猝滅組分，當(dāng)探針完整時(shí)，無(wú)熒光出現(xiàn)。

核酸雜交技術(shù)

核酸雜交是先將待測(cè)核酸固定在膜上，然后用核酸探針與其進(jìn)行雜交，使雜交體帶上標(biāo)記而被顯示出來(lái)。一般采用核酸點(diǎn)雜交法來(lái)檢測(cè)植物病毒，直接把病毒核酸點(diǎn)到NC 膜上再使之與探針雜交;也有的直接把病毒樣品點(diǎn)到NC膜上。檢測(cè)的專化性程度取決于探針與病毒核酸序列的互補(bǔ)程度。核酸雜交技術(shù)適用于DNA病毒、RNA 病毒及類病毒的檢測(cè)，靈敏度高、特異性強(qiáng)，可檢測(cè)到1pg的DNA。