相襯顯微鏡（phasecontrastmicroscope）又稱相差顯微鏡。在光學(xué)顯微鏡的改進(jìn)過程中，相襯顯微鏡的制造成功和普遍的應(yīng)用，是近代顯微鏡技術(shù)中的重要成就。在1935年荷蘭學(xué)者澤尼克（P.Zernike）提出了相襯法原理，至1941年由德國蔡司工廠誕生了世界上第一臺(tái)相襯顯微鏡。它的產(chǎn)生，使人類的視覺在光學(xué)顯微鏡下又得到新的擴(kuò)展。從信息利用的角度來看，人們將它視為光學(xué)信息處理概念下的第一個(gè)產(chǎn)品，因而獲得了1953年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。

普通光學(xué)顯微鏡之所以看不見未染色的組織、細(xì)胞和細(xì)菌、病毒等活機(jī)體的圖像，是因?yàn)橥ㄟ^樣品的光線變化差別（反差）很小。標(biāo)本染色后改變了振幅（亮度）和波長(zhǎng)（顏色），影響了反差而獲得圖像。但是染色會(huì)引起樣品變形，也可使有生命的機(jī)體死亡。要觀察不染色的新鮮組織、細(xì)胞或其他微小活體必須使用相襯顯微鏡。

相襯顯微鏡

在顯微鏡下準(zhǔn)確辯認(rèn)各種正常和病理物質(zhì)，是檢驗(yàn)工作者的基本功。生物標(biāo)本中的細(xì)胞、細(xì)菌等微小、透明的物體，對(duì)光的吸收率和折射指數(shù)等與周圍的介質(zhì)近似，在一般光學(xué)顯微鏡下，往往看不清其明顯的輪廓和細(xì)致的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。用特殊的染色法雖可清楚地看到細(xì)胞的形態(tài)和某些內(nèi)部結(jié)構(gòu)，但也有局限性。生物材料不經(jīng)染色，在自然、活動(dòng)的狀態(tài)下能看清其形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，是生物學(xué)界長(zhǎng)期追求的目標(biāo)。相襯顯微鏡就是適應(yīng)這一要求而發(fā)展起來的一種特殊的顯微鏡裝置。

相襯顯微鏡圖案

相襯顯微鏡的基本原理

當(dāng)一束平行光通過被檢測(cè)標(biāo)本，遇到一種物點(diǎn)時(shí)，由于各物點(diǎn)對(duì)光的吸收程度不同，在顯微鏡視場(chǎng)中可見到灰度(即明暗度)不同的各物點(diǎn)圖像，這是由于光的振幅不同所致。如果標(biāo)本中的物體近乎透明，視場(chǎng)中就看不出明顯的灰度差別。但由于各種物點(diǎn)對(duì)光波產(chǎn)生了衍射和折射，使得通過的光波因延遲而發(fā)生了偏離，其光程就有了一定的差別，即產(chǎn)生了位相差。人眼不能分辨這種位相差，但可以設(shè)法將這種位相差轉(zhuǎn)換成振幅差。相襯顯微鏡顯微鏡就是利用光的干涉原理，將位相差轉(zhuǎn)換成振幅差(即明暗差)的顯微鏡裝置。

相襯顯微鏡基本原理

當(dāng)一束光通過標(biāo)本時(shí)會(huì)遇到如下情況：一部分光通過物點(diǎn)，經(jīng)過衍射等發(fā)生偏離；另一部分沒有被衍射、折射的非偏離光，則均勻地投射于像平面上。偏離光與非偏離光之間的光程相差約1/4，但此時(shí)兩者不會(huì)產(chǎn)生明顯的干涉。如果在顯微鏡的物鏡與目鏡之間加一個(gè)位相板，使其相差再增加1/4(合計(jì)光程相差達(dá)1/2)，這時(shí)偏離光與非偏離光相遇，便產(chǎn)生明顯的干涉(相互抵消)，兩種光波相遇形成的合成波的振幅為兩者之差，光線明顯變暗。而標(biāo)本的介質(zhì)，只有非偏離光通過，不發(fā)生干涉。結(jié)果形成暗色的目的物和明亮的背景的圖像。

相襯顯微鏡的結(jié)構(gòu)

相襯顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)是相同的。不同之處在于：①物鏡鏡頭上面，在物鏡第二焦平面裝有一塊圓盤狀的位相板。②聚光器下面，在聚光器第一焦平面裝有環(huán)形光束，光束上刻有狹窄的縫隙可通過環(huán)形強(qiáng)光。它具有四部分特殊結(jié)構(gòu)：即環(huán)狀光闌、相板、合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡及綠色濾光片。

相襯顯微鏡結(jié)構(gòu)

1、相位板（annular phaseplate）

相位板位于物鏡內(nèi)部的后焦平面上。相位板上有兩個(gè)區(qū)域，直射光通過的部分叫“共軛面”，衍射光通過的部分叫“補(bǔ)償面”。帶有相位板的物鏡叫相差物鏡，常以“Ph”字樣標(biāo)在物鏡外殼上。

相差物鏡是顯微鏡特有的重要裝置。在相差特鏡內(nèi)的后焦面上裝有種類不同的相位板。相位板由于前述的作用，造成視場(chǎng)中被檢樣品影像與背景不同的明暗反差，各具不同的效果。因物鏡內(nèi)相板種類或構(gòu)成的不同，物鏡在明暗反差上可區(qū)分為兩大類，即明反差（B）或負(fù)反差（N）物鏡和暗反差（D）或正反差（P）物鏡。

同一反差類別的物鏡，依放大率的不同，又可分為10×、20×、×40、和100×數(shù)種，因此，相關(guān)物鏡種類頗多，一套可多達(dá)20余種。 相差物鏡多為消色差物鏡或平場(chǎng)消色差物鏡（PL）。

2、轉(zhuǎn)盤聚光器（turret condenser）

位于鏡臺(tái)之下，普通聚光器的所在位置上，由聚光鏡和環(huán)狀光闌（annular diapheragm）構(gòu)成。環(huán)狀光闌位于聚光鏡之下，是一種特殊的光闌裝置，由大小不同的環(huán)狀通光孔構(gòu)成，不同規(guī)格的通光孔——環(huán)狀光闌裝配在一個(gè)可旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)盤上，按需要調(diào)轉(zhuǎn)使用。環(huán)狀光闌的環(huán)寬與直徑各不相同，與不同放大率的相差物鏡內(nèi)的相板相匹配，不可濫用。

3、合軸調(diào)中望遠(yuǎn)鏡（centering telescope）

合軸調(diào)中望遠(yuǎn)鏡簡(jiǎn)稱CT，又名合軸調(diào)中目鏡。它是眼透鏡，可行升降調(diào)節(jié)，具有較長(zhǎng)的焦距的一種望遠(yuǎn)目鏡。鏡筒較長(zhǎng)，其直徑與觀察目鏡相同。它的功用僅作為環(huán)狀光闌的環(huán)孔（亮環(huán)）與相差物鏡相板的共軛面環(huán)孔（暗環(huán)）的調(diào)中合軸與調(diào)焦之用。

相襯顯微鏡使用時(shí)，轉(zhuǎn)盤聚光器的環(huán)狀光闌與相差目鏡必須匹配，且環(huán)狀光闌的孔環(huán)與相差物鏡相板共軛面的環(huán)孔在光路中要準(zhǔn)確合軸，并完全吻合或重疊。以保證直射光和衍射光各行其路，使成像光線的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢姷恼穹?。但是，鏡體的光路中前述兩環(huán)的影像較小，一般目鏡難以辨清，不能進(jìn)行調(diào)焦與合軸的操作，非借助合軸調(diào)中望遠(yuǎn)鏡不可。

4、綠色濾色鏡（green filter）

相差物鏡的種類，從色差消除情況來分，多屬消色差物鏡或PL物鏡。消色差物鏡的最佳清清晰范圍的光譜區(qū)為510-630nm。欲提高相襯顯微鏡的性能最好以波長(zhǎng)范圍小的單色光照明，即接物鏡最佳清晰范圍的波長(zhǎng)的光線進(jìn)行照明。所以，使用相差物鏡時(shí)，在光路上加用透射光線波長(zhǎng)為500-600nm左右的綠色濾色鏡，使照明光線中的紅光和藍(lán)光被吸收，只透過綠光，可提高物鏡的分辨能力。濾色鏡兼有吸熱的作用，以利活體觀察。

相襯顯微鏡圖像的特點(diǎn)

相襯顯微鏡有暗相差（又稱正相差）和明相差（又稱負(fù)相差）之分，醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)上一般多用暗相差。暗相襯顯微鏡下看到的細(xì)胞和細(xì)菌，與染色后的見到的大不相同。例如，新鮮血液中的紅細(xì)胞顯得暗而厚重，且細(xì)胞周圍有一圈明亮的暈（一般細(xì)胞、細(xì)菌等外周均有一圈亮?xí)灒t細(xì)胞最為明顯）；中性粒細(xì)胞核不太明顯，而胞漿中的顆粒卻比較明顯，與瑞氏染色結(jié)果恰恰相反。新鮮的血液中，還可以見到中性粒細(xì)胞的阿米巴樣活動(dòng)；細(xì)菌及其鞭毛、莢膜等明顯可見。

相襯顯微鏡的使用

1、安裝相差裝置 將普通顯微鏡的聚光鏡卸下，將帶環(huán)狀光欄的聚光鏡裝到相匹配的顯微鏡上;將顯微鏡的普通物鏡卸下，換上帶位相板的物鏡；將目鏡換成相襯顯微鏡專用的調(diào)焦目鏡;在光源進(jìn)光處放置專用的綠色濾光片（有時(shí)可以不用）。

2、對(duì)光和聚焦 通過調(diào)焦目鏡和粗細(xì)調(diào)節(jié)螺旋的調(diào)節(jié)，直至視野中可清晰地看到有一個(gè)白圈和一個(gè)黑圈。黑圈是固定的，白圈則可通過聚光鏡裝置上的調(diào)節(jié)螺旋加以移動(dòng)，使黑圈與白圈完全重合。取下調(diào)焦目鏡，換上顯微鏡原來的目鏡，即可進(jìn)行檢查。

相襯顯微鏡調(diào)焦

相襯顯微鏡的臨床應(yīng)用

相襯顯微鏡主要用于新鮮液體標(biāo)本中細(xì)胞和微生物的檢查,尤其適用于活細(xì)胞檢查。一般是取新鮮液體標(biāo)本,加上蓋玻片(如用油鏡時(shí),還需在蓋玻片上滴加鏡油)立即進(jìn)行檢驗(yàn)。當(dāng)前相襯顯微鏡主要用于以下幾個(gè)方面：

1、血液學(xué)檢驗(yàn)

用于血小板計(jì)數(shù)、血液中寄生蟲檢查和某些活細(xì)胞觀察等。血小板體積小而透明,一般光學(xué)顯微鏡很難看清。新鮮血液直接用相襯顯微鏡檢查,可以觀察到瘧原蟲滋養(yǎng)體在紅細(xì)胞內(nèi)呈阿米巴樣活潑運(yùn)動(dòng)。也可看到中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和吞噬細(xì)菌和異物(如碳顆粒)等現(xiàn)象。

2、尿分析

用于辨認(rèn)新鮮尿中各種細(xì)胞和管型,特別是透明管型、白細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞以及紅細(xì)胞形態(tài)的分類等。

3、微生物學(xué)檢驗(yàn)

用于不染色或染不上色的細(xì)菌、螺旋體、真菌孢子等的快速辨認(rèn),特別是對(duì)具有鞭毛、莢膜等特殊形態(tài)微生物的鑒別。

4、對(duì)活細(xì)胞的連續(xù)觀察

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中,不允許對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行染色。為了對(duì)活細(xì)胞連續(xù)觀察,必須在專用的倒置顯微鏡中加相差裝置。

相襯顯微鏡使用注意事項(xiàng)

1、相位倒轉(zhuǎn) 當(dāng)n’ n或n’ n時(shí)得到象的明暗反差正好相反，稱為相位倒轉(zhuǎn)。當(dāng)相位差δ=0時(shí)是無法識(shí)別的，隨著δ的增大反差變大，當(dāng)δ繼續(xù)增大到某一值后會(huì)出現(xiàn)相位倒轉(zhuǎn)。用90%高吸光值（高反差）物鏡時(shí)，這個(gè)轉(zhuǎn)變值約為0.55λ，用70%標(biāo)準(zhǔn)吸光值的物鏡時(shí)約為0.33λ。較高吸光值的物鏡應(yīng)該用于分辨較小的光程差。

2、暈輪和漸暗效應(yīng)

在相襯顯微鏡成象過程中，某一結(jié)構(gòu)由于相位的延遲而變暗時(shí)，并不是光的損失，而是光在象平面上重新分配的結(jié)果。因此在黑暗區(qū)域明顯消失的光會(huì)在較暗物體的周圍出現(xiàn)一個(gè)明亮的暈輪。這是相襯顯微鏡的缺點(diǎn)，它妨礙了精細(xì)結(jié)構(gòu)的觀察，當(dāng)環(huán)狀光闌很窄時(shí)暈輪現(xiàn)象更為嚴(yán)重。相襯顯微鏡的另一個(gè)現(xiàn)象是漸暗效應(yīng)，指相差觀察相位延遲相同的較大區(qū)域時(shí)，該區(qū)域邊緣會(huì)出現(xiàn)反差下降。

3、樣品厚度的影響

當(dāng)進(jìn)行相差觀察時(shí)，樣品的厚度應(yīng)該為5μm或者更薄，當(dāng)采用較厚的樣品時(shí)，樣品的上層是很清楚的，深層則會(huì)模糊不清并且會(huì)產(chǎn)生相位移干擾及光的散射干擾。

4、蓋玻片和載玻片的影響

樣品一定要蓋上蓋上蓋玻片，否則環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板的暗環(huán)很難重合。相差觀察對(duì)載玻片和蓋玻片的玻璃質(zhì)量也有較高的要求，當(dāng)有劃痕，厚薄不均或凹凸不平時(shí)會(huì)產(chǎn)生亮環(huán)歪斜及相位干擾。另外玻片過厚或過薄時(shí)會(huì)使環(huán)狀光闌亮環(huán)變大或變小。