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文檔簡(jiǎn)介 顯色基質(zhì)鱟試劑盒使用說(shuō)明書(shū)（終點(diǎn)顯色法，含偶氮化試劑）【用途】顯色基質(zhì)鱟試劑（ChromogenicEnd-pointTachypleusAmebocyteLysate,CETAL）用于體外細(xì)菌內(nèi)毒素的定量檢測(cè)，禁止以任何途徑進(jìn)入機(jī)體?！驹怼亏c試劑為鱟科動(dòng)物東方鱟的血液變形細(xì)胞溶解物的冷凍干燥品,鱟試劑中含有Ｃ因子、Ｂ因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。在適宜的條件下（溫度，pH值及無(wú)干擾物質(zhì)），細(xì)菌內(nèi)毒素激活C因子，引起一系列酶促反應(yīng)，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的顯色基質(zhì)，使其分解為多肽和黃色的對(duì)硝基苯胺（pNA，λmax=405nm）。在一定時(shí)間內(nèi)，pNA的生成量與細(xì)菌內(nèi)毒素濃度成正相關(guān)，據(jù)此，可以定量供試品的內(nèi)毒素濃度。同時(shí)，對(duì)硝基苯胺（pNA）也可用偶氮化試劑染成玫瑰紅色（λmax=545nm），避免了供試品本身的顏色對(duì)405nm處吸收峰的干擾?！緳z測(cè)限】按反應(yīng)時(shí)間不同可檢測(cè)0.1EU/ml-1EU/ml和0.01EU/ml-0.1EU/ml兩個(gè)區(qū)間（反應(yīng)時(shí)間T1和T2見(jiàn)出廠檢驗(yàn)報(bào)告）。【試劑盒組成】細(xì)菌內(nèi)毒素工作品，2支鱟試劑，1.7ml/支，2支顯色基質(zhì)，1.7ml/支，2支偶氮化試劑1，10ml/支，2支偶氮化試劑2，10ml/支，2支偶氮化試劑3，10ml/支，2支HCl（反應(yīng)終止劑），50ml/瓶，1瓶細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，50ml/瓶，2瓶【貯存】陰涼處,最佳2-8℃,避光貯存?！居梅ā?.材料和設(shè)備1.1試劑鱟試劑、細(xì)菌內(nèi)毒素工作品、顯色基質(zhì)、偶氮化試劑1、偶氮化試劑2、偶氮化試劑3、HCl（反應(yīng)終止劑）、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。1.2器材旋渦混合儀、移液器、多道移液器、封口膜、試管架。恒溫水浴箱（37±1℃）、分光光度計(jì)。注意：接觸試劑及供試品的所有器皿必須是無(wú)熱原的（我公司提供無(wú)熱原耗材）。玻璃器皿可經(jīng)250℃干烤至少60分鐘去除熱原。2.供試品的貯存與預(yù)處理備注：若供試品為血液類，請(qǐng)參照配套血液相關(guān)處理試劑使用說(shuō)明書(shū)。2.1供試品的pH值應(yīng)在6-8之間，若超出此范圍，需用無(wú)熱原緩沖液、0.1N氫氧化鈉或0.1N鹽酸調(diào)節(jié)。2.2若供試品中可能存在鱟實(shí)驗(yàn)的干擾物質(zhì)，處理參見(jiàn)【供試品的干擾試驗(yàn)】。2.3若供試品中可能含有β－葡聚糖（β－葡聚糖會(huì)產(chǎn)生G因子旁路反應(yīng)，干擾內(nèi)毒素檢測(cè)），需選用特異性鱟試劑（我公司提供）。2.4若供試品為一些抗菌素如頭孢類抗菌素和磺胺制劑會(huì)對(duì)偶氮染色劑產(chǎn)生偶聯(lián)反應(yīng)而干擾偶氮化顯色，需要選用不含偶氮化試劑的試劑盒（我公司提供）。2.5若供試品的本底吸光度值大于0.5,必須對(duì)供試品進(jìn)行稀釋后再檢測(cè)。2.6若供試品顏色較深（例如溶血），或在酸性條件下顏色加深（例如一些組織培養(yǎng)介質(zhì)）,必須設(shè)置供試品空白管以扣除供試品自身的顏色本底。供試品空白管不加入鱟試劑，以等體積鱟試劑的溶劑（該處為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水）代替。其余操作同供試品管。3.實(shí)驗(yàn)操作3.1細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線所采用的內(nèi)毒素濃度可以為0.01,0.025,0.05,0.1EU/ml或0.1,0.25,0.5,1.0EU/ml。稀釋方法如下（以0.1,0.25,0.5,1.0EU/ml為例）：取細(xì)菌內(nèi)毒素工作品1支，按細(xì)菌內(nèi)毒素工作品使用說(shuō)明書(shū)稀釋為10EU/ml的內(nèi)毒素溶液，再稀釋為1.0EU/ml的內(nèi)毒素溶液，以1.0EU/ml的內(nèi)毒素溶液為母液按下表稀釋成0.1,0.25,0.5,1.0EU/ml的濃度梯度。配制好的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)用完。表1內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制內(nèi)毒素濃度（EU/ml）10.50.250.1加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（ml）00.50.750.9加1EU/ml內(nèi)毒素溶液（ml）10.50.250.1鱟試劑：按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于鱟試劑中，輕輕振搖使鱟試劑完全溶解,注意不要用旋渦混勻儀激烈振搖。溶解的鱟試劑應(yīng)在10分鐘內(nèi)用完。顯色基質(zhì)：按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于顯色基質(zhì)中，輕輕振搖使顯色基質(zhì)完全溶解。顯色基質(zhì)溶液可在無(wú)污染的條件下于4C貯存8小時(shí)以內(nèi)。偶氮化試劑1：按標(biāo)示量加反應(yīng)終止劑鹽酸于偶氮化試劑1中，偶氮化試劑2：按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于偶氮化試劑2中，偶氮化試劑3：按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于偶氮化試劑3中，偶氮化試劑溶液可于4C貯存1周。3.4實(shí)驗(yàn)操作取無(wú)熱原試管，加入100ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，或供試品。再加入100ml鱟試劑溶液，混勻，37C溫育T1分鐘。溫育結(jié)束，加入100ml顯色基質(zhì)溶液，混勻，37C溫育T2分鐘。溫育結(jié)束，加入500ml偶氮化試劑1溶液，混勻，加入500ml偶氮化試劑2溶液，混勻加入500ml偶氮化試劑3溶液，混勻，靜置5分鐘，于545nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值。（見(jiàn)表２）表2實(shí)驗(yàn)操作陰性對(duì)照內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)供試品加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（ml）100加內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液（ml）100加供試品（ml）100加鱟試劑（ml）100100100混勻，37C溫育T1分鐘加顯色基質(zhì)溶液（ml）100100100混勻，37C溫育T2分鐘加偶氮化試劑1溶液（ml）5005005004.數(shù)據(jù)處理建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=bX+a，其中Y為545nm處吸光度值，X為內(nèi)毒素的濃度，b為直線斜率，a為Y軸截距。當(dāng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)同時(shí)滿足如下三個(gè)條件時(shí)實(shí)驗(yàn)才有效：1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r≥0.980，2.標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)的Y值大于陰性對(duì)照的Y值，3.供試品平行管的平均值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的區(qū)間內(nèi)?！竟┰嚻返母蓴_試驗(yàn)】供試品的干擾試驗(yàn)詳見(jiàn)《中華人民共和國(guó)藥典》2005版中《細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法》的“光度測(cè)定法干擾試驗(yàn)”。當(dāng)鱟試劑、供試品的來(lái)源、配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，須進(jìn)行干擾試驗(yàn),步驟如下:1選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或一個(gè)靠近中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度（設(shè)為λm），作為供試品干擾試驗(yàn)中添加的內(nèi)毒素濃度，配制含λm內(nèi)毒素的供試品陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)量出該溶液的內(nèi)毒素濃度,稱為Cs；2測(cè)量出未添加外源內(nèi)毒素的供試品溶液內(nèi)毒素濃度,稱為Ct；3計(jì)算該試驗(yàn)條件下的回收率R＝（CsCt）/λm×100%4當(dāng)R在50%～200%之間，則認(rèn)為在此試驗(yàn)條件下供試品溶液不存在干擾作用。5當(dāng)R在50%～200%之外，需對(duì)供試品進(jìn)行系列稀釋（稀釋倍數(shù)不得超過(guò)最大有效稀釋倍數(shù)MVD）或進(jìn)行其它處理消除干擾,每一稀釋溶液都重復(fù)步驟1-3,直到內(nèi)毒素的回收率R在50%～200%之間。選擇回收率R最接近100%的稀釋倍數(shù)進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)。
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