培養(yǎng)基，是指供給微生物、植物或動物(或組織)生長繁殖的，由不同營養(yǎng)物質(zhì)組合配制而成的營養(yǎng)基質(zhì)。培養(yǎng)基配成后一般需測試并調(diào)節(jié)pH，還須進行滅菌，通常有高溫滅菌和過濾滅菌。培養(yǎng)基由于富含營養(yǎng)物質(zhì)，易被污染或變質(zhì)。配好后不宜久置，最好現(xiàn)配現(xiàn)用。

一、培養(yǎng)基配制和滅菌原理

1、培養(yǎng)基是提供微生物生長、繁殖、代謝的混合養(yǎng)料。因為不同的微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的要求各不相同，加之實驗和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類很多。雖然種類很多，但是培養(yǎng)基中一般含有必需的碳源、氮源、無機鹽以及水分等，另外，培養(yǎng)基還應有適宜的pH。

2、瓊脂是應用最廣泛的凝固劑，加瓊脂制成的培養(yǎng)基在98-100℃下融化，45℃以下凝固。然而，如果瓊脂多次反復融化，其凝固性就會降低。

3、任何一種培養(yǎng)基一旦制成必須及時滅菌。一般培養(yǎng)基滅菌采用高壓蒸汽滅菌。

二、配制最普通的細菌培養(yǎng)基

1、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應用廣泛和最普通的細菌培養(yǎng)基(普通培養(yǎng)基)，它含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl，其中牛肉膏為微生物提供了碳源和能量，蛋白胨主要提供了氮源，而NaCl提供了無機鹽。因為這種培養(yǎng)基多用于培養(yǎng)細菌，所以要用稀酸或稀堿將其pH調(diào)到7.2-7.4，以利于細菌的生長。

2、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方

牛肉膏：3g;蛋白胨：10g;NaCl：5g;水：1000mL;pH：7.2-7.4;瓊脂：15-20g。

3、儀器與試劑

牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂、質(zhì)量分數(shù)為10%的鹽酸、質(zhì)量分數(shù)為10%的氫氧化鈉、燒杯、三角燒瓶、量筒、玻璃棒、玻璃漏斗、酒精燈、培養(yǎng)皿、牛皮紙、繩、天平、牛角匙、精密pH試紙、滅菌鍋、超凈工作臺等。

4、步驟

(1)稱量

根據(jù)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方依次準確稱取各種藥品，放入適當大小的燒杯中。牛肉膏放在小燒杯里稱量，用熱水融化后倒入大燒杯中。蛋白胨易潮濕，稱量要快。

應注意的是，1把牛角匙用于1種藥品，藥瓶蓋不要蓋錯。瓊脂稱好后不要急于加入到其他藥品中。

(2)融化

在大燒杯中先加少于所需要的水量，把稱好的各種原料成分按照配方依次加入到大杯中(牛肉膏可用50mL燒杯稱量，并用少許熱水溶解后再加入大燒杯中)，用玻璃棒攪勻，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解，等所有加入的原料全部溶解后，補充水分到所需的體積。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種固體培養(yǎng)基，需要加瓊脂使其凝固。大燒杯用酒精燈加熱至沸騰后加入瓊脂，繼續(xù)加熱至瓊脂完全融化(在加熱過程中要用玻璃棒不斷攪拌，以防瓊脂沸騰溢出或瓊脂糊底導致燒杯破裂)。

最后補足所蒸發(fā)的水分。應注意的是，培養(yǎng)基中的各種無機鹽可能相互作用產(chǎn)生沉淀，因此在混合培養(yǎng)基成分時，一般是按配方的順序依次溶解各成分，甚至有時還需要將2種或多種成分分別滅菌，使用時再按比例混合。

(3)調(diào)節(jié)pH

根據(jù)培養(yǎng)基對pH的要求，用質(zhì)量分數(shù)為10%的鹽酸或質(zhì)量分數(shù)為10%的氫氧化鈉溶液調(diào)至所需pH。測定pH可用精密pH試紙或酸度計等。

在未調(diào)pH前，先用精密pH試紙測量培養(yǎng)基的原始pH，如果pH偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入質(zhì)量分數(shù)為10%的氫氧化鈉溶液，邊加邊攪拌，并隨時用精密pH試紙測其pH，直至pH達7.2-7.4。反之，用10%鹽酸溶液調(diào)節(jié)。應注意的是，pH不要調(diào)過頭，以免回調(diào)影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的質(zhì)量分數(shù)。

(4)過濾

如果是液體培養(yǎng)基，就要在玻璃漏斗中放一層濾紙;如果是固體培養(yǎng)基或半固體培養(yǎng)基，則需在漏斗中放多層紗布或2層紗布夾1層薄薄的脫脂棉趁熱過濾。若無特殊要求，這一步就可以省去。

(5)分裝

如下圖所示，采用該分裝器分裝時不要使培養(yǎng)基沾染在管口或瓶口，以免引起污染。

應注意的是，液體分裝高度以試管高度的1/4左右為宜;固體分裝的量一般為管高的1/5;半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜;分裝三角瓶，其裝量以不超過三角瓶容積的一半為宜。

(6)包扎標記

培養(yǎng)基分裝好后加好棉塞或試管帽，再包上一層防潮紙(筆者實驗時用牛皮紙)，并用棉線包扎好。在分裝好的瓶上貼上標簽，寫清培養(yǎng)基名稱、組別、配制時間等。

(7)滅菌(下文有詳細介紹)

(8)擱置斜面

將分裝在試管內(nèi)的培養(yǎng)基滅菌后冷卻至50℃，將試管有棉塞端擱在玻璃棒上，擱置的試管斜面長度以不超過試管總長度的一半為宜。

(9)無菌檢查

將滅菌的培養(yǎng)基放在37℃恒溫箱中培養(yǎng)24-48h，檢查滅菌是否徹底。

三、培養(yǎng)基滅菌

1、定義：用理化方法殺死一定物質(zhì)中的微生物的微生物學基本技術。

2、生物學中最常見的滅菌方法：干熱滅菌，濕熱滅菌。

(1)干熱滅菌

干熱滅菌是利用高溫使微生物細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。干熱滅菌有火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌2種。細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的凝固性與其自身含水量有關，在菌體受熱時，當環(huán)境和細胞內(nèi)含水量越大時，則蛋白質(zhì)凝固就越快，反之凝固緩慢。

與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度要高(160-170℃)，時間要長(1-2h)，但干熱滅菌溫度不能超過180℃，否則，包器皿的紙或棉塞就會烤焦，甚至引起燃燒。

(2)濕熱滅菌(最常見的是高壓蒸汽滅菌)

含水量越高，蛋白質(zhì)凝固所需要的溫度就越低。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，因為在濕熱情況下，菌體吸收水分，使蛋白質(zhì)易于凝固。同時濕熱的穿透力強，可增加滅菌效力。

3、高壓蒸汽滅菌是滅菌效果最好、目前應用最廣的滅菌方法，是微生物學實驗中最常見的滅菌方法。

(1)高壓蒸汽滅菌簡介

高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸汽急劇將鍋內(nèi)冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡時，關閉排氣閥，繼續(xù)加熱。由于水蒸汽無法排出，增加了滅菌鍋內(nèi)的壓力，從而使沸點增高，得到高于100℃的溫度，導致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。

一般培養(yǎng)基在1.05kg/cm2、溫度為121℃的情況下維持15-30min可達到徹底滅菌的目的。滅菌的溫度及維持的時間隨滅菌物品的性質(zhì)和容量等具體情況而有所改變。

(2)高壓蒸汽滅菌的操作過程和注意事項

①加水。打開滅菌鍋蓋，向鍋內(nèi)加水到水位線。應注意的是，水要加夠，防止在滅菌過程中干鍋。

②裝料、加蓋。裝料擺放平整(實踐證明這一環(huán)節(jié)非常重要)。材料放好后，蓋滅菌鍋，采用對角線均勻擰緊鍋蓋上的螺絲，使蒸汽鍋密封，勿漏氣。

③排氣。打開排氣口(放氣閥)，用電加熱，待水煮沸后，水蒸汽和空氣一起從排氣孔排出，當有大量蒸汽排出時，維持5min，使鍋內(nèi)的冷空氣完全排凈。

④升壓、保壓、降壓。當鍋內(nèi)冷空氣排凈后，關閉排氣閥，壓力開始上升。當壓力上升到所需壓力1.05kg/cm2時(可用旋鈕調(diào)節(jié)壓力)，控制壓力以維持恒溫121℃，并開始計算滅菌時間(調(diào)節(jié)滅菌時間按鈕20min即可)。滅菌結(jié)束后拔掉電源，當壓力降至“0”時，打開放氣閥。應注意的是，不能過早打開放氣閥，否則會由于瓶內(nèi)壓力下降的速度比鍋內(nèi)的慢而造成瓶內(nèi)液體沖出容器之外。

⑤滅菌后的培養(yǎng)基空白培養(yǎng)。滅菌后的培養(yǎng)基應放于37℃恒溫箱中培養(yǎng)，經(jīng)驗證24-48h無菌生長后才可保存?zhèn)溆谩?/p>