分子雜交指具有一定同源序列的兩條核酸單鏈(DNA分子或RNA)，在一定條件下按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則經(jīng)過(guò)退火處理，形成異質(zhì)雙鏈的過(guò)程。利用這一原理，就可以使用已知序列的單鏈核酸片段作為分子探針，去查找各種不同來(lái)源的基因組DNA分子中的同源基因或同源序列。

一、DNA分子變性

DNA分子變性是指雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成單鏈無(wú)規(guī)則線團(tuán)，因而發(fā)生性質(zhì)改變(如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等)。

1、DNA分子變性的方法：①加熱;②改變DNA分子溶液的pH;③有機(jī)溶劑(如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等)等理化因素。

2、增色效應(yīng)：DNA分子在260nm處有最大吸收值，這一特征是由于含有堿基的緣故。在DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型中堿基藏于內(nèi)側(cè)，變性時(shí)由于雙螺旋解開，于是堿基外露，260nm紫外吸收值因而增加，這一現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。利用DNA分子變性后波長(zhǎng)260nm處紫外吸收的變化可追蹤變性過(guò)程。

3、溶解曲線：如果升高溫度使DNA分子變性，以溫度對(duì)紫外吸收作圖，可得到一條曲線，稱為溶解曲線。

4、融解溫度：通常人們把50%DNA分子發(fā)生變性的溫度稱為變性溫度(即熔解曲線中點(diǎn)對(duì)應(yīng)的溫度)，由于這一現(xiàn)象和結(jié)晶的融解相類似，故又稱融點(diǎn)或融解溫度。因此Tm是指消光值上升到最大消光值一半時(shí)的溫度。

5、影響Tm值的因素：Tm不是一個(gè)固定的數(shù)值，它與很多因素有關(guān)：

①外部因素：pH、離子強(qiáng)度。隨著溶劑內(nèi)離子強(qiáng)度上升，Tm值也隨著增大。

②內(nèi)部因素：DNA分子的堿基比例、DNA分子的均一性;在相同條件下，DNA分子內(nèi)G-C配對(duì)含量高，其Tm值也高。

二、DNA分子復(fù)性

變性DNA分子只要消除變性條件，二條互補(bǔ)鏈還可以重新結(jié)合，恢復(fù)原來(lái)的雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過(guò)程稱為復(fù)性。

退火：通常DNA分子熱變性后，將溫度緩慢冷卻，并維持在比Tm低25～30℃左右時(shí)，變性后的單鏈DNA分子即可恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，因此，這一過(guò)程又叫做退火。

復(fù)性后的DNA分子，理化性質(zhì)都能得到恢復(fù)。倘若DNA分子熱變后快速冷卻，則不能復(fù)性。

影響復(fù)性速度的因素：

1、DNA分子濃度：愈高，復(fù)性速度也愈快。

2、DNA分子片段的大?。篋NA分子片段愈大，擴(kuò)散速度愈低，使DNA分子片段線狀單鏈互相發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)的機(jī)會(huì)減少。因此，在復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，有時(shí)將DNA分子切成小片段，再進(jìn)行復(fù)性。

3、溫度：過(guò)高不利于復(fù)性。

4、溶液的離子強(qiáng)度：通常鹽濃度較高時(shí)，復(fù)性速度較快。

5、DNA分子順序的復(fù)雜性;簡(jiǎn)單的分子復(fù)性很快，如polyd和polyd由于彼此互補(bǔ)識(shí)別很快，故能迅速?gòu)?fù)性。但順序較復(fù)雜的DNA分子復(fù)性則較慢。因此通過(guò)變性速率的研究，可以了解DNA分子順序的復(fù)雜性。

放射性同位素、生物素或熒光染料進(jìn)行標(biāo)記的已知序列的核酸片段，即為分子探針。分子探針可用于分子雜交，雜交后通過(guò)放射自顯影、熒光檢測(cè)或顯色技術(shù)，使雜交區(qū)帶顯現(xiàn)出來(lái)。

分子探針根據(jù)標(biāo)記物不同可粗分為放射性分子探針和非放射性分子探針兩大類;根據(jù)分子探針的來(lái)源及核酸性質(zhì)不同又可分為DNA分子探針，RNA分子探針，cDNA分子探針，及寡核苷酸分子探針等幾類。

1、DNA分子探針：

DNA分子探針是最常用的核酸分子探針，指長(zhǎng)度在幾百堿基對(duì)以上的雙鏈DNA分子或單鏈DNA分子探針?，F(xiàn)已獲得DNA分子探針數(shù)量很多，有細(xì)菌、病毒、原蟲、真菌、動(dòng)物和人類細(xì)胞DNA分子探針。這類分子探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。

DNA分子探針的獲得有賴于分子克隆技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。以細(xì)菌為例，目前分子雜交技術(shù)用于細(xì)菌的分類和菌種鑒定比之GC百分比值要準(zhǔn)確的多，是細(xì)菌分類學(xué)的一個(gè)發(fā)展方向。加之分子雜交技術(shù)的高敏感性，分子雜交在臨床微生物診斷上具有廣闊的前景。

DNA分子探針(包括cDNA分子探針)的優(yōu)點(diǎn)：

①這類分子探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無(wú)限繁殖，取之不盡，制備方法簡(jiǎn)便。

②不易降解(相對(duì)RNA而言)，一般能有效抑制DNA分子酶活性。

③DNA分子探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移，隨機(jī)引物法等，能用于同位素和非同位素標(biāo)記。

2、cDNA分子探針：

cDNA分子(complementaryDNA分子)分子探針是指互補(bǔ)于mRNA的DNA分子，是由逆轉(zhuǎn)錄酶催化而產(chǎn)生的。該酶以RNA為模板，根據(jù)堿基配對(duì)原則，按照RNA的核苷酸順序合成DNA分子(其中U與A配對(duì))。cDNA分子探針是目前應(yīng)用最為廣泛的一種分子探針。

3、RNA分子探針：

RNA分子探針是一類很有前途的核酸分子探針，由于RNA是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應(yīng)效率極高。早期采用的RNA分子探針是細(xì)胞mRNA分子探針和病毒RNA分子探針，這些RNA是在細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄或病毒復(fù)制過(guò)程中得到標(biāo)記的，標(biāo)記效率往往不高，且受到多種因素的制約。這類RNA分子探針主要用于研究目的，而不是用于檢測(cè)。

4、克隆分子探針：

前述三種分子探針均是可克隆的，一般情況下，只要有克隆的分子探針，就不用寡核苷酸分子探針。在DNA分子序列未知而必須首先進(jìn)行克隆以便繪制酶譜和測(cè)序時(shí)，也常應(yīng)用克隆。

分子雜交可按作用環(huán)境大致分為液相雜交和固相雜交兩種類型。

液相雜交：液相雜交指所參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中。液相雜交是一種研究最早且操作復(fù)合的雜交類型，在過(guò)去的30年里雖有時(shí)被應(yīng)用，但總不如固相雜交那樣普遍。其主要原因是雜交后過(guò)量的未雜交分子探針在溶液中除去較為困難和誤差較高。

固相雜交：固相雜交是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，另一條核酸鏈游離在溶液中。由于固相雜交后，未雜交的游離片段可容易地漂洗除去，膜上留下的雜交物容易檢測(cè)和能防止靶DNA分子自我復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，故該法最為常用。根據(jù)支持物的不同固相雜交又可為：濾膜雜交、菌落分子原位雜交和組織分子原位雜交。

1、原理：

分子原位雜交簡(jiǎn)稱原位雜交，指組織或細(xì)胞的分子原位雜交，它與菌落的分子原位雜交不同。菌落分子原位雜交需裂解細(xì)菌釋出DNA分子，然后進(jìn)行雜交。

而分子原位雜交是經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透性增加，讓分子探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA分子或RNA雜交。因此分子原位雜交可以確定分子探針的互補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置，這一點(diǎn)具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。

2、應(yīng)用：

①對(duì)致密染色體DNA分子的分子原位雜交可用于顯示特定的序列的位置;

②對(duì)分裂期間核DNA分子的雜交可研究特定序列在染色質(zhì)內(nèi)的功能排布;

③與細(xì)胞RNA的雜交可精確分析任何一種RNA在細(xì)胞中和組織中的分布;

④分子原位雜交還是顯示細(xì)胞亞群分布和動(dòng)向及病原微生物存在方式和部位的一種重要技術(shù)。

3、分子探針選擇：

用于分子原位雜交的分子探針可以是單鏈或雙鏈DNA分子，也可以是RNA分子探針。通常分子探針的長(zhǎng)度以100～400bp為宜，過(guò)長(zhǎng)則雜交效率減低。

最近研究結(jié)果表明，寡核苷酸分子探針(16～30bp)能自由出入細(xì)菌和組織細(xì)胞壁，雜交效率明顯高于長(zhǎng)分子探針。因此，寡核苷酸分子探針和不對(duì)稱PCR標(biāo)記的小DNA分子探針或體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記的RNA分子探針是組織分子原位雜交的優(yōu)選分子探針。

4、分子探針的標(biāo)記：

分子探針的標(biāo)記物可以是放射性同位素，也可以是非放射性生物素和半抗原等。

放射性同位素中，3H和35S最為常用。

3H標(biāo)記的分子探針半衰期長(zhǎng)，成像分辨率高，便于定位，缺點(diǎn)是能量低。

35S標(biāo)記分子探針活性較高，影像分辨率也較好。

32P能量過(guò)高，致使產(chǎn)生的影像模糊，不利于確定雜交位點(diǎn)。

5、組織與細(xì)胞的固定：

分子原位雜交中，標(biāo)本的固定條件是影響雜交效率的重要因素，標(biāo)本組織蛋白質(zhì)的消化程度對(duì)分子探針進(jìn)入細(xì)胞極為重要。

去除蛋白的方法是，用0.2mol/LHCl處理載玻片，用蛋白酶K消化，然后用不同濃度的乙醇脫水，分子原位雜交還是一種新技術(shù)，發(fā)展很快，在敏感性、特異性和穩(wěn)定性上還需要進(jìn)一步完善和提高。

1、分子探針的選擇

根據(jù)不同的雜交實(shí)驗(yàn)要求，應(yīng)選擇不同的核酸分子探針。在大多數(shù)情況下，可以選擇克隆的DNA分子或cDNA分子雙鏈分子探針。但是在有些情況下，必須選用其它類型的分子探針如寡核苷酸分子探針和RNA分子探針。

①檢測(cè)靶序列上的單個(gè)堿基改變時(shí)應(yīng)選用寡核苷酸分子探針;

②在檢測(cè)單鏈靶序列時(shí)應(yīng)選用與其互補(bǔ)的DNA分子單鏈分子探針(通過(guò)克隆人M13噬菌體DNA分子獲得)或RNA分子探針，寡核苷酸分子探針也可;

③檢測(cè)復(fù)雜的靶核苷酸序列和病原體應(yīng)選用特異性較強(qiáng)的長(zhǎng)的雙鏈DNA分子探針;

④組織分子原位雜交應(yīng)選用寡核苷酸分子探針和短的PCR標(biāo)記分子探針(80～150bp)，因?yàn)樗淄高^(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)或核內(nèi)。

2、分子探針的標(biāo)記方法

在選擇分子探針類型的同時(shí)，還需要選擇標(biāo)記方法。分子探針的標(biāo)記方法很多，選擇什么標(biāo)記方法主要視個(gè)人的習(xí)慣和可利用條件而定。但在選擇標(biāo)記方法時(shí)，還應(yīng)考慮實(shí)驗(yàn)的要求，如靈敏度和顯示方法等。一般認(rèn)為放射性分子探針比非放射性分子探針的靈敏度高。

放射性分子探針的實(shí)際靈敏度不依賴于所采用的標(biāo)記方法，如隨機(jī)引物延伸法往往得到比缺口平移法更高的比活性。在檢測(cè)單拷貝基因序列時(shí)，應(yīng)選用標(biāo)記效率高、顯示靈敏的分子探針標(biāo)記方法。在對(duì)靈敏要求不高時(shí)，可采用保存時(shí)間長(zhǎng)的生物素分子探針技術(shù)和比較穩(wěn)定的堿性磷酸酶顯示系統(tǒng)。

3、分子探針的濃度

隨分子探針濃度增加，雜交率也增加。在較窄的范圍內(nèi)，隨分子探針濃度增加，敏感性增加。要獲得較滿意的敏感性，膜雜交中32P標(biāo)記分子探針與非放射性標(biāo)記分子探針的用量分別為5～10ng/ml和25～1000ng/ml，而分子原位雜交中，無(wú)論應(yīng)用何種標(biāo)記分子探針，其用量均為0.5～5.0μg/ml。分子探針的任何內(nèi)在物理特性均不影響其使用濃度，但受不同類型標(biāo)記物的固相支持物的非特異結(jié)合特性的影響。

4、雜交率

傳統(tǒng)雜交率分析主要用于DNA分子復(fù)性研究，在這種情況下，分子探針和靶鏈在溶液中的濃度相同。現(xiàn)代雜交實(shí)驗(yàn)無(wú)論在液相雜交還是固相雜交均在分子探針過(guò)剩的條件下進(jìn)行，此外，固相雜交中靶序列不在液相，故其濃度不能精確計(jì)算。

5、雜交最適溫度

雜交技術(shù)最重要的因素之一是選擇最適的雜交反應(yīng)溫度。若反應(yīng)溫度低于Tm的10～15℃，堿基順序高度同源的互補(bǔ)鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯(cuò)配對(duì)減少。若反應(yīng)溫度再低(Tm-30℃)，雖然互補(bǔ)鏈之間也可形成穩(wěn)定的雙鏈，但互補(bǔ)堿基配對(duì)減少，錯(cuò)配對(duì)增多、氫鍵結(jié)合的更弱。如兩個(gè)同源性在50%左右或更低些的DNA分子，調(diào)整雜交溫度可使它們之間的雜交率變化10倍，因此在實(shí)驗(yàn)前必須首先確定雜交溫度。

6、雜交的嚴(yán)格性

影響雜交體穩(wěn)定性的因素決定著雜交條件的嚴(yán)格性。一般認(rèn)為在低于雜交體Tm值25℃時(shí)雜交最佳，所以首先要根據(jù)公式計(jì)算雜交體Tm值。通過(guò)調(diào)節(jié)鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來(lái)控制所需的嚴(yán)格性。

7、雜交反應(yīng)時(shí)間

在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時(shí)間。時(shí)間短了，雜交反應(yīng)不完成;時(shí)間長(zhǎng)了也無(wú)益，會(huì)引起非特異結(jié)合增多。一般雜交反應(yīng)要進(jìn)行20h左右。

8、雜交促進(jìn)劑

雜交促進(jìn)劑可用來(lái)促進(jìn)250個(gè)堿基以上的分子探針的雜交率。對(duì)單鏈分子探針可增加3倍，而對(duì)雙鏈分子探針、隨機(jī)剪切或隨機(jī)引物標(biāo)記的分子探針可增加高達(dá)100倍。而短分子探針不需用促進(jìn)劑，因其復(fù)雜度低和分子量小，短分子探針本身的雜交率就高。