蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)用于蛋白質(zhì)的分離純化，蛋白質(zhì)的分離純化在生物化學(xué)研究應(yīng)用中使用廣泛，是一項(xiàng)重要的操作技術(shù)。 一個(gè)典型的真核細(xì)胞可以包含數(shù)以千計(jì)的不同蛋白質(zhì)，一些含量十分豐富，一些僅含有幾個(gè)拷貝。為了研究某一個(gè)蛋白質(zhì)，必須首先將該蛋白質(zhì)從其他蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)分子中純化出來。

蛋白質(zhì)純化的主要方法及注意事項(xiàng)

蛋白質(zhì)的分離純化在生物化學(xué)研究應(yīng)用中使用廣泛，是一項(xiàng)重要的操作技術(shù)。 一個(gè)典型的真核細(xì)胞可以包含數(shù)以千計(jì)的不同蛋白質(zhì)，一些含量十分豐富，一些僅含有幾個(gè)拷貝。為了...[查看全部]

蛋白質(zhì)的分離純化的步驟 ： 蛋白質(zhì)純化的主要方法及注意事項(xiàng)蛋白質(zhì)純化的原則蛋白質(zhì)純化方法-沉淀法蛋白質(zhì)純化方法-親和層析蛋白質(zhì)純化方法-層析方法

通常，對某一特定蛋白質(zhì)的分離純化的步驟包括前處理、粗分級、細(xì)分級三步，下面就讓小編帶你了解一下。

前處理：

對于某種蛋白質(zhì)的分離純化，首先需要通過溶解的狀態(tài)從原來的組織或細(xì)胞中釋放出蛋白質(zhì)并且使原來的天然狀態(tài)保持不變，從而使生物活性不丟失生。之后，按照不同的情況，選擇適當(dāng)?shù)姆椒?，破碎掉組織和細(xì)胞?？梢允褂秒妱?dòng)搗碎機(jī)或勻漿機(jī)破碎或超聲波對動(dòng)物組織和細(xì)胞進(jìn)行處理破碎。

如果所要的蛋白主要在如細(xì)胞核、染色體、核糖體或可溶性細(xì)胞質(zhì)等某一細(xì)胞組分集中，那么可以通過差速離心的方法分開它們，對該細(xì)胞組分進(jìn)行收集以作下步純化的材料。如果所要蛋白是與細(xì)胞膜或膜質(zhì)細(xì)胞器結(jié)合的，那么必須使用超聲波或去污劑解聚膜結(jié)構(gòu)，然后使用適當(dāng)介質(zhì)來提取。

粗分離

當(dāng)獲得蛋白質(zhì)提取液（有時(shí)還雜有核酸、多糖之類）以后，選擇合適的方法來分離所要的蛋白與其他雜蛋白。通常使用鹽析、等電點(diǎn)沉淀和有機(jī)溶劑分級分離等方法來進(jìn)行這一步的分離。這些方法不但操作簡單，而且能夠處理很多，既可以將大量的雜質(zhì)除去，又可以使蛋白溶液濃縮。一些蛋白提取液體積比較打，使用沉淀或鹽析法濃縮又不適用，那么進(jìn)行濃縮的方法可以是超過濾、凝膠過濾、冷凍真空干燥或其他方法。

細(xì)分離

樣品在進(jìn)行粗分級分離以后，通常只有很小的體積，以及去除了絕大多數(shù)的雜蛋白大部分。通常使用包括凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等層析法來進(jìn)行進(jìn)一步純化。作為最后的純化步驟選擇包括區(qū)帶電泳、等電點(diǎn)聚焦等電泳法也很有必要。蛋白質(zhì)分離純化的最后步驟結(jié)晶，結(jié)晶過程不能夠使蛋白一定是均一得到確保，然而只有在溶液中某種蛋白在數(shù)量上占有優(yōu)勢時(shí)才能有結(jié)晶形成。

離子層析法

當(dāng)被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時(shí)，會在離子交換劑上吸附帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)，之后通過對pH進(jìn)行改變等方法洗脫吸附的蛋白質(zhì)。

有機(jī)溶劑提取

與水互溶的有機(jī)溶劑(如甲醇、乙醇)可以顯著降低一些蛋白質(zhì)在水中的溶解度，并且

... 查看全文
蛋白質(zhì)純化方法-沉淀法 ： 蛋白質(zhì)的分離純化的步驟蛋白質(zhì)純化的主要方法及注意事項(xiàng)蛋白質(zhì)純化的原則蛋白質(zhì)純化方法-親和層析蛋白質(zhì)純化方法-層析方法

沉淀法

沉淀法又叫做溶解度法。通過各種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)差異性來使溶液的某些性質(zhì)得到改變，進(jìn)而改變有效成分的溶解度，為其純化生命大分子物質(zhì)的基本原理。

1、蛋白質(zhì)沉淀劑

蛋白質(zhì)沉淀劑只會對一類或一種蛋白質(zhì)沉淀起作用，常見的有堿性蛋白質(zhì)、凝集素和重金屬等。

2、聚乙二醇沉淀作用

聚乙二醇和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型聚合物能夠使得蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀作用。

3、選擇性沉淀法

按照在不同物理化學(xué)因子作用下，各種蛋白質(zhì)穩(wěn)定性不同的特點(diǎn)，使用適當(dāng)?shù)倪x擇性沉淀法，就能夠使雜蛋白變性沉淀，而在溶液中仍然保留欲分離的有效成分，從而使得純化有效成分的目的達(dá)到。

4、鹽析法

在稀鹽溶液中，隨著鹽濃度的增高，蛋白質(zhì)的溶解度也會上升，然而當(dāng)鹽濃度增高到一定數(shù)值時(shí)，降低了水活度，從而造成蛋白質(zhì)分子表面電荷逐漸被中和，逐漸破壞了水化膜，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間互相凝聚并從溶液中析出。

5、有機(jī)溶劑沉淀法

有機(jī)溶劑可以使得蛋白質(zhì)溶解度降低，有如下兩點(diǎn)原因：

（1）和水相比，有機(jī)溶劑的介電常數(shù)更加的小，從而減小了溶劑的極性。

（2）起到脫水的作用，和鹽溶液相同。

... 查看全文
蛋白質(zhì)純化的原則 ： 蛋白質(zhì)的分離純化的步驟蛋白質(zhì)純化方法-沉淀法蛋白質(zhì)純化方法-親和層析蛋白質(zhì)純化方法-層析方法蛋白質(zhì)純化方法-聚焦層析

蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)用于蛋白質(zhì)的分離純化，蛋白質(zhì)的分離純化在生物化學(xué)研究應(yīng)用中使用廣泛，是一項(xiàng)重要的操作技術(shù)。 一個(gè)典型的真核細(xì)胞可以包含數(shù)以千計(jì)的不同蛋白質(zhì)，一些含量十分豐富，一些僅含有幾個(gè)拷貝。為了研究某一個(gè)蛋白質(zhì)，必須首先將該蛋白質(zhì)從其他蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)分子中純化出來。

原則

蛋白純化對不同蛋白間內(nèi)在的相似性與差異進(jìn)行利用，對各種蛋白間的相似性進(jìn)行利用來將非蛋白物質(zhì)的污染去除并且而利用各蛋白質(zhì)的差異從其他蛋白中純化出目的蛋白。每種蛋白間的大小、形狀、電荷、疏水性、溶解度和生物學(xué)活性均會存在差異，利用這些差異能夠從如大腸桿菌裂解物等混合物中將蛋白提取出來，從而使重組蛋白得到。

粗分離和精細(xì)純化階段為蛋白的純化主要的兩個(gè)階段。通常采用樹脂法來進(jìn)行蛋白的純化。

粗分離階段主要分開目的蛋白和如DNA、RNA等其他細(xì)胞成分，因?yàn)?，這個(gè)時(shí)候，樣板具有比較大的體積，比較雜的成分，因而所用的樹脂應(yīng)當(dāng)滿足寬粒徑分布，大顆粒，流速高，以及容量高的特點(diǎn)，并且能夠迅速分開蛋白與污染物，如有必要，可以將如蛋白酶抑制劑的相應(yīng)的保護(hù)劑加入，避免降解目的蛋白。

精細(xì)純化階段則則需要達(dá)到更高的分辨率要求，這個(gè)階段需要區(qū)分開目的蛋白與那些分子量大小及理化性質(zhì)接近的蛋白，為了使分辨率提高，需要使用更加小的樹脂顆粒。離子交換柱和疏水柱經(jīng)常被使用，樹脂的選擇性和柱效兩個(gè)因素在應(yīng)用的時(shí)候需要綜合考慮。

蛋白質(zhì)純化

蛋白質(zhì)的的物理、化學(xué)、生物化學(xué)、物理化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)取決于它的一級、二級、三級和四級結(jié)構(gòu)，不同蛋白質(zhì)之間的性質(zhì)存在差異或者改變條件是使之具有差異，利用一種同時(shí)多種性質(zhì)差異，在兼顧收率和純度的情況下，選擇蛋白質(zhì)提純的方法。

蛋白質(zhì)通常通常均是由復(fù)雜的混合物形式存在于組織或細(xì)胞中，有成千種不同的蛋白質(zhì)存在于每種類型的細(xì)胞內(nèi)。分離和提純蛋白質(zhì)非常的艱巨而繁重。直到現(xiàn)在還不能夠從復(fù)雜的混合物中使用一個(gè)單獨(dú)的或一套現(xiàn)成的方法提取出任

... 查看全文