腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移與糖鏈的表達密切相關(guān)。一些腫瘤細胞糖基化修飾的改變能夠影響細胞的周期調(diào)控和細胞的增殖能力，促進腫瘤的發(fā)展，但具體分子機制尚不清晰。來自美國紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)院的科研小組借助糖基化研究新工具 凝集素芯片，發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)驅(qū)動因子，進而找到其上游調(diào)控因子以及下游靶向因子，揭開了黑色素瘤轉(zhuǎn)移機制，相關(guān)結(jié)果發(fā)表在國際頂級學(xué)術(shù)期刊Cancer cell上（PMID: 28609658）。

 
技術(shù)背景 凝集素芯片介紹

凝集素（Lectin）是一類自然界廣泛存在的蛋白質(zhì)，具有特定糖結(jié)構(gòu)識別的特性。利用凝集素進行特定糖結(jié)構(gòu)的解析是糖生物學(xué)研究領(lǐng)域的常用手段。凝集素芯片是將多種經(jīng)典凝集素以微陣列的形式固定在高分子三維芯片片基上，形成高通量凝集素芯片，可進行多種糖結(jié)構(gòu)的同步篩選和交叉驗證。
1、凝集素芯片篩選糖基化譜

首先，研究人員通過凝集素芯片對臨床黑色素瘤樣本進行差異糖蛋白篩選。重點分析黑色素瘤原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中糖基化差異，找到了發(fā)生顯著變化的四種糖基化修飾（綠色方框表示該糖基化在原發(fā)灶中高表達，轉(zhuǎn)移灶中低表達；紅色方框表示該糖基化在原發(fā)灶中低表達，轉(zhuǎn)移灶中高表達。同時，研究人員從TCGA、GEO數(shù)據(jù)庫中提取獲得相對應(yīng)的糖基化基因的表達水平數(shù)據(jù)，見圖1。（PS: TCGA (The cancer genome atlas)是目前最重要的癌癥基因信息數(shù)據(jù)庫，其主要收錄各種人類癌癥的臨床數(shù)據(jù)，基因組變異，mRNA表達，miRNA表達，甲基化等數(shù)據(jù)，是癌癥研究者很重要的數(shù)據(jù)來源。GEO數(shù)據(jù)庫（Gene expression Omnibus)是NCBI的基因表達數(shù)據(jù)庫，也是當今最大、最全面的公共基因表達數(shù)據(jù)資源。）
 

圖1 黑色素瘤原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中糖基化檢測與糖基因表達水平分析

 
2、體外實驗：糖基化基因功能驗證
  隨后，科研人員在黑色素瘤細胞系中，應(yīng)用siRNA技術(shù)對先前篩到的差異糖基化基因進行功能驗證。細胞侵襲實驗結(jié)果證實FUT1、FUT2的沉默促進腫瘤轉(zhuǎn)移，而抑制FUT8后，腫瘤轉(zhuǎn)移明顯下降。免疫熒光和免疫組化結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)移灶中凝集素LCH等識別的N核心巖藻糖基化（糖基化基因為FUT8）表達明顯升高，而凝集素UEA-I等識別的 -1,2巖藻糖基化（糖基化基因為FUT1/ FUT2）表達顯著降低，見圖2。
 

圖2 體外實驗驗證糖基化基因功能

 
3、體外 體內(nèi)實驗：糖基化基因FUT8功能確證
  對于藥物開發(fā)來說，在轉(zhuǎn)移灶中上調(diào)的指標FUT8相對更容易作為藥物靶點。因此，研究人員后續(xù)重點關(guān)注FUT8，推測FUT8可能是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的驅(qū)動子。進一步，通過體外和體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，敲減FUT8，細胞侵襲受到抑制，黑色素瘤體內(nèi)侵襲能力也有明顯下調(diào)，證實FUT8的表達與腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲密切相關(guān)，如圖3。
 

圖3 糖基化基因FUT8功能確證

4、FUT8上下游轉(zhuǎn)移機制研究
  研究人員采用Matinspector software轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測軟件結(jié)合ChIP Enrichment Analysis database找了一系列FUT8上游轉(zhuǎn)錄因子，并通過siRNA實驗，證實TGIF2作為上游轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控FUT8的表達，見圖4。
 

圖4 FUT8上游調(diào)控因子分析

研究人員選取3株不同的黑色素瘤細胞系，通過核心巖藻糖凝集素pull-down結(jié)合MS鑒定，鑒定到三個樣本中共同擁有的114種巖藻糖基化修飾的蛋白。進一步進行GO分析，發(fā)現(xiàn)一系列與細胞運動遷移相關(guān)的蛋白，如L1CAM、NRP2，見圖5。
 

圖5 FUT8下游靶向控因子分析

 
5. FUT8靶向L1CAM 促進腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲

根據(jù)前期文獻報道，L1CAM與黑色素瘤發(fā)展密切相關(guān)，因此研究人員推測FUT8可能通過促進L1CAM的巖藻糖基化來促進腫瘤轉(zhuǎn)移。實驗結(jié)果顯示：在過表達L1CAM的腫瘤細胞中敲減FUT8，L1CAM核心巖藻糖基化程度下降，侵襲能力下降；過表達FUT8，敲減L1CAM可以明顯抑制腫瘤侵襲。L1CAM的N核心巖藻糖基化可以保護其不被蛋白酶識別剪切，從而促進了腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，如圖6。
 

圖6 FUT8靶向L1CAM促進腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲

 
小結(jié)：

在這項研究中，研究人員應(yīng)用凝集素芯片，找到黑色素瘤轉(zhuǎn)移灶中高表達的4種糖基化修飾類型。進一步根據(jù)差異糖基化尋找糖基化差異基因，發(fā)現(xiàn)FUT8參與黑色素瘤轉(zhuǎn)移。TGIF2調(diào)節(jié)FUT8的轉(zhuǎn)錄促使在轉(zhuǎn)移灶中的高表達，而FUT8介導(dǎo)L1CAM的N核心巖藻糖基化水平上升，導(dǎo)致plasmin無法識別L1CAM，失去對L1CAM的水解作用，而全長的L1CAM可以促進腫瘤轉(zhuǎn)移，如圖7。關(guān)于凝集素芯片，我們經(jīng)?？吹降膱蟮蓝际羌膊酥疚锵嚓P(guān)的研究。本文通過凝集素芯片進行深入的腫瘤轉(zhuǎn)移機制研究，說明了糖基化基因可以成為驅(qū)動腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的癌基因，為腫瘤及其他疾病深入機理探索提供了新的切入點和研究思路，值得推薦。
 

圖7  FUT8促進腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲模式圖

華盈生物作為中國蛋白芯片行業(yè)的標桿企業(yè)，我們著力打造蛋白芯片全產(chǎn)品線和系統(tǒng)性解決方案。我們提供的凝集素芯片覆蓋有55種常見凝集素，能夠為疾病機理研究、疾病標志物研究、糖修飾組研究等提供強大技術(shù)支撐。

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英文文獻鏈接：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28609658