EvaGreen 是一種無(wú)致突變性、無(wú)細(xì)胞毒性的DNA結(jié)合染料，NaicaTM Crystal全自動(dòng)微滴芯片數(shù)字PCR儀系統(tǒng)可兼容EvaGreen 染料進(jìn)行的數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)分析。 

反應(yīng)體系中游離的的EvaGreen 染料不發(fā)出熒光信號(hào)，但與雙鏈DNA（dsDNA）結(jié)合后會(huì)發(fā)出很強(qiáng)的熒光。NaicaTM Crystal全自動(dòng)微滴芯片數(shù)字PCR儀系統(tǒng)使用檢測(cè)參比熒光（熒光素鈉鹽）相同的濾光片可進(jìn)行EvaGreen 染料熒光信號(hào)的檢測(cè)。 

使用NaicaTM Crystal全自動(dòng)微滴芯片數(shù)字PCR儀系統(tǒng)，EvaGreen 可以通過(guò)使用簡(jiǎn)單的引物來(lái)實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)絕對(duì)定量。使用我們的Sapphire芯片、基于EvaGreen 的方法可檢測(cè)低至0.2copies/ L。

圖1：基于EvaGreen 染料方法的基因組DNA絕對(duì)定量

對(duì)未進(jìn)行片段化的人基因組DNA進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)瑵舛确秶鷱?000-0.2copies/ L，使用NaicaTM Crystal全自動(dòng)微滴芯片數(shù)字PCR儀系統(tǒng)進(jìn)行絕對(duì)定量，使用1.5XEvaGreen ，1XPerfeCTa @ UNG Tough mix，擴(kuò)增片段大小為104bp的EGFR基因片段。為了保證重復(fù)性和穩(wěn)定性我們進(jìn)行了三次重復(fù)（R2= 0.9977）。在NTC（無(wú)模板對(duì)照）孔中沒(méi)有觀察到陽(yáng)性微滴。

當(dāng)使用EvaGreen 方法進(jìn)行數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要注意，加入PCR mix的模板dsDNA濃度過(guò)高將導(dǎo)致較高的背景熒光。此外，EvaGreen 染料與dsDNA具有較高的親和力，但同時(shí)也與存在mix中的寡核苷酸有較低的親和力，導(dǎo)致背景熒光的增加。 

根據(jù)您所需定量的DNA類(lèi)型和數(shù)字PCR反應(yīng)體系，需要預(yù)估實(shí)際的動(dòng)態(tài)范圍。

圖2：EvaGreen 絕對(duì)定量散點(diǎn)圖

對(duì)未片段化的人類(lèi)的基因組DNA進(jìn)行倍比稀釋后，濃度范圍1000-0.2copies/ L，使用NaicaTM Crystal全自動(dòng)微滴芯片數(shù)字PCR儀系統(tǒng)進(jìn)行絕對(duì)定量，使用1.5XEvaGreen ，1XPerfeCTa @ UNG Tough mix，擴(kuò)增片段大小為104bp的EGFR基因片段。

灰色點(diǎn)：陰性微滴，藍(lán)色點(diǎn)：陽(yáng)性微滴。

RFU：相對(duì)熒光強(qiáng)度。