加入有機(jī)溶劑之后測量移動相酸堿度

校準(zhǔn)pH計(jì)，得到水溶液的正確pH回讀值——您要驗(yàn)證的緩沖液是含水的。如果你用有機(jī)添加劑測量pH值，得到的pH值會與添加有機(jī)溶劑之前的值不同。

然而，最重要的一點(diǎn)是要保持一致。如果你總是在加入有機(jī)溶劑之后測量pH值，那么務(wù)必保證在使用的方法中陳述你的步驟，這樣的話其他人就會按照統(tǒng)一方式進(jìn)行。這種方式并不保證百分百準(zhǔn)確，但是至少可以保持方法的前后統(tǒng)一。這也許會比得到精準(zhǔn)的pH值更加重要。

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沒有使用緩沖液

緩沖劑的作用就是用來控制Ph值并阻止其發(fā)生變化。很多其他方法會改變流動相的Ph值，會引起停留時(shí)間、峰形以及峰值響應(yīng)的漂移。

甲酸、TFA等不是緩沖劑。

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沒有在正常酸堿度范圍內(nèi)使用緩沖液

每個緩沖鹽有2個pH單位范圍寬度，在這個范圍內(nèi)可以提供穩(wěn)定性最佳的pH值。窗口之外的緩沖鹽不具備有效的抗pH值變化能力。要么在正確的范圍內(nèi)使用緩沖劑，要么選擇一種緩沖劑可以涵蓋你所需要的pH值。

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向有機(jī)溶液中加緩沖液

將緩沖溶液與有機(jī)相混合，會極有可能引起緩沖液沉淀。在很多情況下，即使沉淀現(xiàn)象已經(jīng)發(fā)生了，但仍很難被發(fā)現(xiàn)。記住，一定要將有機(jī)溶液加入到水相當(dāng)中，這可以很好的降低緩沖液沉淀的幾率。

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從0%用泵混合濃度梯度

現(xiàn)在使用的泵可以有效的混合流動相并實(shí)現(xiàn)在線脫氣，但并不是使用你的方法的任何人都會配有高質(zhì)量的泵。將A和B混合到一個單獨(dú)的溶液中，在100%線上運(yùn)行。

比如說通過用50ml水混合制備有機(jī)950ml起始混合物。這樣做的好處就是可以減少HPLC之間的可變性，減少系統(tǒng)中產(chǎn)生氣泡和沉淀的可能性。值得注意的是泵混合液的比例是95:5并不代表瓶體的預(yù)混合保留時(shí)間也為95:5。

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不要使用正確的改性酸或改性堿改變緩沖液

只能使用形成你使用的緩沖鹽的酸或堿。比如磷酸鈉緩沖液應(yīng)僅用磷酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)。

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沒有在方法中闡述有關(guān)緩沖液的全部信息，比如說在1000ml的水中加入5g磷酸鈉

緩沖劑的類型決定了能夠緩沖的Ph范圍。所需的濃度決定了緩沖強(qiáng)度。5克或無水磷酸鈉和5克一水合物磷酸一鈉具有不同的緩沖強(qiáng)度。

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還沒先檢查就開始添加有機(jī)溶液

如果上一個方法中基線B中使用過的是緩沖液，而你的方法中，基線B使用的是有機(jī)溶液，好在你可以沉淀泵管和泵頭中的緩沖劑。

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支起瓶體清空最后一滴

很有可能你沒有足夠的流動相完成整個操作，最后樣品會冒煙的。除了可能存在燒干泵系統(tǒng)和柱子的可能性之外，流動相也會蒸發(fā)的一干二凈，瓶體頂部的流動相會發(fā)生變化。

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利用超聲脫氣的流動相

最重要的一點(diǎn)就是確保所有的緩沖鹽已經(jīng)溶解，但是這是一種效果最差的脫氣方式，并且它會很快讓流動相升溫，從而引起有機(jī)成分蒸發(fā)掉。為了省去之后不必要的麻煩，請用五分鐘時(shí)間使用真空過濾你的流動相。