PCR概念

　　聚合酶鏈反應(yīng)(基因擴(kuò)增)：基本原理 類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程，在體外特異性擴(kuò)增DNA片段的一種技術(shù)。

　　PCR的應(yīng)用領(lǐng)域

　　1、遺傳病和某些疑難病的診斷

　　2、病原體的檢測(cè)。某些惡性疾病一般用微生物學(xué)、生化和免疫 學(xué)技術(shù)無(wú)法查出病原體時(shí)，可用PCR來(lái)檢查。

　　3、法醫(yī)和刑偵鑒定。

　　4、癌基因的檢查。

　　5、基因探針的制備。

　　6、基因組測(cè)序、染色體巡視。

　　7、cDNA庫(kù)的構(gòu)建。

　　8、基因突變的分析和定位誘變。

　　9、DNA重組。

　　10、基因的分享和克隆。

　　標(biāo)準(zhǔn)的PCR過(guò)程分為三步

　　DNA變性

　　(90℃-96℃)：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA

　　退火

　　(60℃-65℃)：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。

　　延伸

　　(70℃-75℃)：在Taq酶(在72℃左右，活性最佳)的作用下，以dNTP為原料，從引物的3′端開(kāi)始以從5′??′端的方向延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。

　　PCR儀的分類

　　根據(jù)DNA擴(kuò)增的目的和檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)可以將PCR儀分為普通PCR儀，梯度PCR儀，原位PCR，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀等幾類。

　　普通PCR儀

　　一般把一次PCR擴(kuò)增只能運(yùn)行一個(gè)特定退火溫度的PCR儀，稱之為普通PCR儀。如果要用它做不同的退火溫度則需要多次運(yùn)行。主要是用作簡(jiǎn)單的，對(duì)目的基因退火溫度的擴(kuò)增。

　　梯度PCR儀

　　一次性PCR擴(kuò)增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件(通常12種溫度梯度)的稱之為梯度PCR儀。因?yàn)楸粩U(kuò)增的不同的DNA片段其最適合的退火溫度不同，通過(guò)設(shè)置一系列的梯度退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增，從而一次性PCR擴(kuò)增就可以篩選出表達(dá)量高的最適合退火溫度進(jìn)行有效的擴(kuò)增。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴(kuò)增，這樣既節(jié)約時(shí)間，也節(jié)約經(jīng)費(fèi)。在不設(shè)置梯度的情況下亦可當(dāng)做普通的PCR用。

　　原位PCR儀

　　是用于從細(xì)胞內(nèi)靶DNA的定位分析的細(xì)胞內(nèi)基因擴(kuò)增儀。如病原基因在細(xì)胞的位置或目的基因在細(xì)胞內(nèi)的作用位置等?？杀３旨?xì)胞或組織的完整性，使PCR反應(yīng)體系滲透到組織和細(xì)胞中，在細(xì)胞的靶DNA所在的位置進(jìn)行基因擴(kuò)增。不但可以檢測(cè)到靶DNA，還能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置。于分子和細(xì)胞水平上研究疾病的發(fā)病機(jī)理和臨床過(guò)程及病理的轉(zhuǎn)變有著重大的實(shí)用價(jià)值。

　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀

　　在普通PCR儀基礎(chǔ)上增加一個(gè)熒光信號(hào)采集系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)，就成了熒光定量PCR。其PCR擴(kuò)增原理和普通PCR擴(kuò)增原理相同，只是在PCR擴(kuò)增時(shí)加入的引物是利用同位素、熒光素等進(jìn)行標(biāo)記，使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合擴(kuò)增。擴(kuò)增的結(jié)果通過(guò)熒光信號(hào)采集系統(tǒng)實(shí)時(shí)采集信號(hào)連接輸送到計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)，得出量化的實(shí)時(shí)結(jié)果輸出。

　　熒光定量PCR儀有單通道，雙通道和多通道之分。當(dāng)只用一種熒光探針標(biāo)記的時(shí)候，選用單通道;有多種熒光標(biāo)記的時(shí)候使用多通道。單通道也可以檢測(cè)多熒光的標(biāo)記和目的基因表達(dá)產(chǎn)物，因?yàn)橐淮沃荒軝z測(cè)一種目的基因的擴(kuò)增量，需多次擴(kuò)增才能檢測(cè)完不同的目的基因片段的量。

　　PCR的各個(gè)品牌

　　國(guó)產(chǎn)品牌

　　上海領(lǐng)成、西安天隆、杭州郎基、珠海黑馬、杭州博日、上海宏石、廈門(mén)安普利、杭州晶格、北京亞力恩、北京東勝、上海楓嶺。

　　目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)主要被：上海領(lǐng)成，西安天隆，杭州郞基，珠海黑馬，杭州博日五大品牌所占有。

　　普通PCR儀價(jià)格在18000-20000元左右，梯度PCR儀價(jià)格在26000-28000元左右，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀價(jià)格在130000-150000元左右。

　　進(jìn)口品牌

　　美國(guó)ABI、美國(guó)Labnet萊伯特、美國(guó)Bio-rad伯樂(lè)、英國(guó)Genetech、英國(guó)Techne、德國(guó)Eppendorf艾本德、新加坡Esco藝思高、日本TaKaRa、日本ASTEC、澳大利亞Corbett柯柏特、德國(guó)Jena耶拿、德國(guó)biometra、德國(guó)BOECO、英國(guó)CLEAVER科麗沃、瑞士ROCHE羅氏、英國(guó)Quanta、德國(guó)PEQLAB、荷蘭Creacon、美國(guó)Cepheid、美國(guó)Thermo熱電。

　　目前進(jìn)口品牌中美國(guó)ABI，美國(guó)labnet，美國(guó)Bio-rad，日本TaKaRa，英國(guó)Techne，德國(guó)Eppendorf六大品牌占有率比較高。

　　根據(jù)近年來(lái)銷量分析，其中美國(guó)ABI除了9700型普通PCR基因擴(kuò)增儀和2720型基因擴(kuò)增儀外，新推出的高精確性的Veriti梯度PCR儀，也是所有進(jìn)口品牌梯度PCR儀中最受客戶認(rèn)可的一款，是近兩年來(lái)銷量較高一款PCR儀;

　　其次是美國(guó)Bio-rad;

　　日本TaKaRa和美國(guó)Labnet梯度PCR儀，價(jià)格相對(duì)進(jìn)口品牌中比較便宜，質(zhì)量和性能也比較穩(wěn)定，從而深廣大客戶的認(rèn)可，他們的銷售成交價(jià)在45000-50000左右，而其它同性能價(jià)格的儀器價(jià)格在，60000-80000元，所以近年來(lái)市場(chǎng)的占有率呈上升的趨勢(shì);

　　德國(guó)Eppendorf和美國(guó)Bio-rad是以直銷的模式銷售，因其壟斷直銷方式，外面的經(jīng)銷商或者當(dāng)?shù)氐慕?jīng)銷商無(wú)法進(jìn)去競(jìng)爭(zhēng)，所以相同性能的產(chǎn)品價(jià)格相對(duì)其他品牌要高很多，成交價(jià)格一般在7-9萬(wàn)元左右，市場(chǎng)占有率相對(duì)有所下降;

　　英國(guó)Techne在國(guó)內(nèi)生產(chǎn)，價(jià)格相對(duì)進(jìn)口品牌中要低很多，銷量有所上升，市場(chǎng)占有率也上升，價(jià)格在35000-40000元左右。

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