科研進(jìn)展

　　2018年5月25日，生命中心PI施一公教授研究組就剪接體的組裝機(jī)理與結(jié)構(gòu)研究于《科學(xué)》(Science)雜志以長(zhǎng)文形式再次發(fā)表重大研究成果。這篇題為《完全組裝的釀酒酵母剪接體激活前結(jié)構(gòu)》(Structures of the Fully Assembled Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Before Activation)的論文報(bào)道了釀酒酵母剪接體處于被激活前階段的兩個(gè)完全組裝的關(guān)鍵構(gòu)象——預(yù)催化剪接體前體(precursor pre-catalytic spliceosome，定義為“pre-B復(fù)合物”)和預(yù)催化剪接體(pre-catalytic spliceosome，定義為“B復(fù)合物”)。這兩個(gè)整體分辨率分別為3.3-4.6埃和3.9埃的高分辨率三維結(jié)構(gòu)首次展示了在剪接體組裝過程中 pre-mRNA的5’剪接位點(diǎn)和分支點(diǎn)(BPS)的識(shí)別狀態(tài)與動(dòng)態(tài)變化，回答了剪接體激活前pre-mRNA的5’剪接位點(diǎn)和分支點(diǎn)識(shí)別機(jī)理，以及激活過程中5’剪接位點(diǎn)和分支點(diǎn)如何逐步進(jìn)入活性位點(diǎn)、剪接體如何逐步組裝并通過結(jié)構(gòu)重組最終完成激活等重要問題。

　　RNA剪接是真核生物基因表達(dá)調(diào)控的重要環(huán)節(jié)之一。上世紀(jì)70年代，科學(xué)家們首次發(fā)現(xiàn)真核生物基因的不連續(xù)性，從而表明遺傳信息從DNA轉(zhuǎn)移到RNA上之后，需要經(jīng)歷有效遺傳信息的 “剪斷”與重新“拼接”，這種有效遺傳信息的拼接與“無效”遺傳信息的去除，被稱為RNA剪接。RNA剪接普遍存在于真核生物中，隨著物種的進(jìn)化，含有內(nèi)含子的基因數(shù)量增加，發(fā)生RNA剪接的頻率也相應(yīng)增高，使得一個(gè)基因編碼多個(gè)蛋白質(zhì)成為可能。RNA剪接的本質(zhì)是兩步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，這種看似簡(jiǎn)單的化學(xué)反應(yīng)在細(xì)胞中難以自行發(fā)生，而負(fù)責(zé)執(zhí)行這一化學(xué)反應(yīng)的是細(xì)胞核內(nèi)一個(gè)巨大且高度動(dòng)態(tài)變化的分子機(jī)器——剪接體(spliceosome)。在剪接反應(yīng)過程中，多種蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物及剪接因子按照高度精確的順序發(fā)生結(jié)合和解聚，依次形成預(yù)組裝復(fù)合物U4/U6.U5 Tri-snRNP(U4/U6.U5三小核核糖核蛋白復(fù)合物)以及至少8個(gè)狀態(tài)的剪接體pre-B、B、Bact、B*、C、C*、P以及ILS復(fù)合物。

　　由于剪接體高度的動(dòng)態(tài)性和復(fù)雜性，獲得不同狀態(tài)的剪接體的高分辨率三維結(jié)構(gòu)被公認(rèn)為世界難題。在這種巨大的挑戰(zhàn)下，施一公教授率領(lǐng)研究組迎難而上，經(jīng)過7年的努力，終于在2015年首次報(bào)道了裂殖酵母剪接體3.6埃的高分辨率結(jié)構(gòu)，首次展示了剪接體催化中心近原子分辨率的結(jié)構(gòu)。這一重大研究成果對(duì)RNA剪接機(jī)理的研究產(chǎn)生革命性影響。自2015年第一個(gè)剪接體結(jié)構(gòu)發(fā)表以后，施一公研究組相繼解析了釀酒酵母剪接體復(fù)合物處于6個(gè)不同狀態(tài)的高分辨率結(jié)構(gòu)，分別是3.8埃的預(yù)組裝復(fù)合物U4/U6.U5 Tri-snRNP、3.5埃的激活狀態(tài)復(fù)合物Bact complex、3.4埃的第一步催化反應(yīng)后復(fù)合物C complex、4.0埃的第二步催化激活狀態(tài)下的C* complex、3.6埃的完成兩步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)后狀態(tài)下的P complex，以及3.5埃的內(nèi)含子套索剪接體ILS complex的結(jié)構(gòu)。這些已解析的剪接體基本覆蓋了整個(gè)RNA剪接循環(huán)，從分子層面揭示了剪接體催化RNA剪接兩步反應(yīng)的工作機(jī)理，同時(shí)為理解剪接體的激活和解聚等過程的發(fā)生提供依據(jù)。然而，想要清楚解釋剪接體是如何逐步組裝并完成激活的機(jī)制仍有困難，而最新發(fā)表的這篇文章所解析的兩個(gè)關(guān)鍵狀態(tài)的剪接體，則彌補(bǔ)了領(lǐng)域內(nèi)對(duì)這一部分研究的缺陷。

　　本文報(bào)道的處于激活前的兩個(gè)完全組裝的剪接體結(jié)構(gòu)，從復(fù)合物的提純、樣品的制備到結(jié)構(gòu)的解析，每一步都十分具有挑戰(zhàn)。預(yù)催化剪接體前體(pre-B complex)由U1 snRNP、U2 snRNP以及U4/U6.U5 tri-snRNP組成，目前被認(rèn)為是組成蛋白最多、分子量最大的剪接體，該狀態(tài)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，但各組分之間的相互作用并不緊密，使得該復(fù)合物在提純過程中十分容易解聚。在最新發(fā)表的這篇《科學(xué)》文章中，施一公研究組對(duì)提純方案多次探索，最終優(yōu)化出一套可以獲得穩(wěn)定的、性質(zhì)良好的pre-B complex樣品。隨后利用單顆粒冷凍電鏡技術(shù)重構(gòu)出了U1 snRNP、U2 snRNP以及U4/U6.U5 tri-snRNP部分分辨率高達(dá)3.3埃、3.6-4.6埃以及3.4埃的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，并搭建了原子模型(圖1)。

　　圖1 釀酒酵母預(yù)催化剪接體前體和預(yù)催化剪接體的三維結(jié)構(gòu)

　　該文解析的pre-B complex結(jié)構(gòu)是目前世界上已解析的唯一一個(gè)同時(shí)包含五種核糖核蛋白(snRNP)剪接體結(jié)構(gòu)，它由68個(gè)蛋白和6條RNA組成。在該結(jié)構(gòu)中，首次觀察到了剪接體組裝早期U1 snRNP對(duì)5’剪接位點(diǎn)的識(shí)別，以及五種核糖核蛋白之間的相互作用界面。與此同時(shí)，該文還報(bào)道了處于pre-B complex之后的另一個(gè)完全組裝的剪接體，即預(yù)催化剪接體B complex的高分辨率三維結(jié)構(gòu)。結(jié)合B complex的結(jié)構(gòu)信息，通過結(jié)構(gòu)對(duì)比，可以清楚的看到在組裝過程中，pre-mRNA的5’剪接位點(diǎn)由一開始被U1 snRNP識(shí)別，而后由于構(gòu)象變化被轉(zhuǎn)移并與U6 snRNA配對(duì)，這一步的變化為剪接體激活提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。除此之外，分支點(diǎn)的動(dòng)態(tài)變化、剪接體的各組分所經(jīng)歷的結(jié)構(gòu)重組與構(gòu)象改變也都清晰的呈現(xiàn)出來。在文章最后，根據(jù)pre-B的結(jié)構(gòu)特征，作者還大膽推測(cè)了最早期的不完全組裝的預(yù)剪接體(pre-spliceosome，定義為“A 復(fù)合物”)的三維結(jié)構(gòu)模型(如圖2)。這兩個(gè)關(guān)鍵狀態(tài)剪接體結(jié)構(gòu)的解析，為揭示剪接體組裝初期如何識(shí)別5’剪接位點(diǎn)和分支點(diǎn)、如何進(jìn)行結(jié)構(gòu)重組以及如何完成剪接體的激活等問題的機(jī)理提供了最直接、有效的結(jié)構(gòu)證據(jù)，也將為更高等真核生物可變剪接的研究提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)與理論依據(jù)。

　　圖2 釀酒酵母預(yù)剪接體三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)與剪接體組裝并激活的模型

　　截至目前為止，施一公研究組在酵母中一共解析了9個(gè)不同狀態(tài)的剪接體高分辨的三維結(jié)構(gòu)(如圖3)，從組裝到被激活，從發(fā)生兩步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)到剪接體的解聚，這9 個(gè)狀態(tài)的剪接體完整覆蓋了剪接通路，首次將剪接體介導(dǎo)RNA剪接的過程串聯(lián)起來，為理解RNA剪接的分子機(jī)理提供了最清晰、最全面的結(jié)構(gòu)信息。

　　圖3 施一公研究組解析的酵母剪接體結(jié)構(gòu)匯總(圖片來源： Shi Lab)

　　生命中心PI施一公為本文的通訊作者;清華大學(xué)生命學(xué)院三年級(jí)博士研究生白蕊、醫(yī)學(xué)院博士后萬蕊雪以及生命學(xué)院博士后閆創(chuàng)業(yè)為該文的共同第一作者;清華大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)的雷建林博士為冷凍電鏡數(shù)據(jù)收集提供了幫助。電鏡數(shù)據(jù)采集于清華大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)，計(jì)算工作得到清華大學(xué)高性能計(jì)算平臺(tái)、國(guó)家蛋白質(zhì)設(shè)施實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心(北京)的支持。本工作獲得了北京結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心及國(guó)家自然科學(xué)基金委的經(jīng)費(fèi)支持。

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