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? ??圖 ?ORC通過(guò)彎曲DNA來(lái)進(jìn)一步加載DNA復(fù)制解旋酶MCM2-7的過(guò)程模式圖

? ? 在國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào)：31761163004、31725007、31630087)等資助下，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院高寧教授課題組與香港科技大學(xué)戴碧瓘教授課題組合作，解析了釀酒酵母ORC結(jié)合DNA復(fù)制起始位點(diǎn)3-?分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。研究成果以 “Structure of the Origin Recognition Complex Bound to DNA Replication Origin”(結(jié)合有復(fù)制起點(diǎn)DNA的起點(diǎn)識(shí)別復(fù)合物結(jié)構(gòu))為題，于2018年7月4日以長(zhǎng)文(Article)形式在Nature(《自然》)上發(fā)表。北京大學(xué)高寧教授和香港科技大學(xué)戴碧瓘教授、翟元樑博士為共同通訊作者。高寧課題組博士后李寧寧、博士生程稼萱以及戴碧瓘組博士后林偉熙、翟元樑為共同第一作者。

? ? DNA復(fù)制起始在真核生物細(xì)胞中受到嚴(yán)格而精密的調(diào)控。DNA復(fù)制啟動(dòng)因子(ORC，Origin Recognition Complex)首先結(jié)合到DNA復(fù)制起點(diǎn)，以加載DNA復(fù)制解旋酶MCM2-7復(fù)合物到DNA上，隨后MCM2-7被激活，DNA雙鏈被解螺旋，從而啟動(dòng)DNA復(fù)制。所有真核生物都是利用由6個(gè)亞基組成的ORC來(lái)標(biāo)記DNA復(fù)制起始的位點(diǎn)，在維持基因組穩(wěn)定性過(guò)程中的重要作用，其功能缺失突變與腫瘤的發(fā)生發(fā)展也密切相關(guān)。

? ? 雖然在不同的真核生物中，ORC的蛋白質(zhì)序列高度保守，但是ORC對(duì)DNA復(fù)制起點(diǎn)序列的選擇性在不同物種間差別很大。釀酒酵母的ORC可以識(shí)別特異的DNA復(fù)制起點(diǎn)，而人源細(xì)胞ORC結(jié)合的DNA序列卻沒(méi)有序列特異性，主要依賴(lài)染色體結(jié)構(gòu)識(shí)別復(fù)制起點(diǎn)。而由于一直缺少ORC結(jié)合DNA狀態(tài)的高分辨結(jié)構(gòu)，ORC序列識(shí)別差異背后的分子機(jī)制長(zhǎng)期以來(lái)難以解釋。

? ? 高寧研究員課題組解析的3-?分辨率ORC-ARS305 DNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，ARS305包含一段ARS高度保守序列(ARS Consensus Sequence, ACS)和一段B1元件序列，長(zhǎng)度為72 bp。在這個(gè)結(jié)構(gòu)中，ORC的六個(gè)亞基通過(guò)與磷酸骨架的非特異性以及與堿基的特異性相互作用環(huán)繞DNA，并在ACS和B1位點(diǎn)使DNA發(fā)生彎曲。該結(jié)構(gòu)的一個(gè)關(guān)鍵特征是Orc1的保守堿性氨基酸區(qū)域(Orc1-BP，basic patch)深深地插入ACS的小溝中進(jìn)行序列特異的堿基識(shí)別。另外，酵母特有的具有物種特異性的位于Orc4 Wing Helix結(jié)構(gòu)域(WHD)中的Helix Insertion(Orc4-IH)嵌入ACS的大溝中，與相應(yīng)的堿基形成疏水相互作用。更重要的是，在ACS區(qū)域形成的這些堿基特異的相互作用的堿基都非常保守。此外，在B1區(qū)域中，也有類(lèi)似的來(lái)自O(shè)rc2和Orc5的堿性氨基酸區(qū)域插入到大溝和小溝中，與堿基相互作用，并使DNA彎曲。因此，釀酒酵母ORC高度序列特異性主要是通過(guò)ORC亞基的大溝、小溝插入基序與ACS保守堿基之間的特異性相互作用實(shí)現(xiàn)的。序列比對(duì)分析顯示，所有真核生物Orc1的N端都具有類(lèi)似釀酒酵母的Orc1-BP;然而Orc4-IH卻只在釀酒酵母中存在。這些發(fā)現(xiàn)，很大程度上解釋了不同物種ORC識(shí)別起始DNA特異性差異背后的原因。

? ? 此高分辨率結(jié)構(gòu)不僅為理解酵母ORC如何識(shí)別和結(jié)合序列特異性的DNA復(fù)制起點(diǎn)提供了分子基礎(chǔ)，同時(shí)也從分子機(jī)制角度闡明了ORC如何通過(guò)彎曲DNA來(lái)進(jìn)一步加載DNA復(fù)制解旋酶MCM2-7的過(guò)程。