關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）是生物學(xué)特征，會影響安全性和有效性，必須得到密切監(jiān)測，因此需要使用各種分析技術(shù)對分子進(jìn)行大量測試。

定義太空洞？當(dāng)我們在談?wù)撽P(guān)鍵質(zhì)量屬性時我們在談?wù)撌裁矗拷裉靵碚務(wù)劦味葴y定和電荷異構(gòu)體分析。CQA 檢測中，除了聚集體分析至關(guān)重要之外，滴度測定和電荷異構(gòu)體分析也分別起到不同的作用。

滴度測定

滴度測定雖然不直接測量 CQA，但常作為生物治療蛋白生產(chǎn)的第一步質(zhì)量檢查。異常滴度可反映細(xì)胞株或培養(yǎng)基存在的問題，這些問題可能會導(dǎo)致異質(zhì)性或產(chǎn)品出錯而不僅是降低產(chǎn)率。使用 UV 檢測的 Protein A 親和捕獲色譜是生物制藥中用于單克隆抗體 ( mAb )滴度測定的一種普遍方法。許多實(shí)驗(yàn)室選擇基因修飾的重組 Protein A 平臺，因?yàn)橹亟M蛋白質(zhì)通常更穩(wěn)定，有更長的色譜柱壽命。天然（純化）Protein A 的吸引力在于對某些 IgG 具有更緊密的結(jié)合親和性。Protein A 產(chǎn)品可用作預(yù)裝填柱、整體床柱和供用戶填裝使用的松散介質(zhì)。整體床色譜柱具有更大孔徑的篩板，因此不易堵塞，對復(fù)雜樣品基質(zhì)更加耐用。

異常滴度可能需要分析用過的細(xì)胞培養(yǎng)基，以排除低產(chǎn)量的原因。氨基酸是培養(yǎng)基的主要成分，可以通過多種技術(shù)進(jìn)行分析，最常見的是利用 LC/UV 分析衍生化氨基酸。衍生化技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是可以廣泛應(yīng)用，并可通過反應(yīng)化學(xué)引入一定程度的特異性，但是人們對分析未衍生化氨基酸以最大限度縮短樣品前處理時間也越來越感興趣。未衍生化氨基酸不具有 UV 吸收，因此需要用到其他檢測器，如蒸發(fā)光散射( ELSD ) 或質(zhì)譜 ( MS ) 檢測器。

然而，ELSD 的靈敏度不夠高，僅能達(dá)到低納摩爾水平，而衍生化氨基酸的 UV 檢測可以達(dá)到低皮摩爾水平。MS 分析檢測也能得到更高的靈敏度，在數(shù)量級上實(shí)現(xiàn)提升。雖然MS 儀器的成本一直是此方法廣泛使用的阻礙，但其引發(fā)的越來越廣泛的關(guān)注已經(jīng)使供應(yīng)商開始在市場中引入經(jīng)濟(jì)實(shí)惠且切合實(shí)際需求的質(zhì)譜儀。

隨著 MS 更廣泛的使用，快速有效地分離分子量較小的極性分子成為一個需要克服的挑戰(zhàn)。使用反相色譜柱分析離子對可得到非常穩(wěn)定的結(jié)果，但需要專用儀器。過去， 親水相互作用色譜 ( HILIC ) 一直在努力滿足市場對穩(wěn)定性和重現(xiàn)性的要求，而最近推出的色譜柱在這方面已經(jīng)有了重大改進(jìn)。

電荷異構(gòu)體分析

使用 UV 檢測的離子交換色譜 ( IEX ) 常用于分離由 PTM（如賴氨酸截短、脫酰胺或唾液酸化）產(chǎn)生的電荷異構(gòu)體。此項分析通常也在完整蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行，因?yàn)檫@種變化可以被檢測到，但無法進(jìn)行特定的鑒定和定位，IEX 通常使用鹽梯度來進(jìn)行，這些高濃度的非揮發(fā)性鹽不適用于 MS。因此，一個新的關(guān)注點(diǎn)是使用 pH 梯度而非鹽梯度，這樣便可以使用低濃度且可以有效揮發(fā)的緩沖鹽流動相，以便和 MS 聯(lián)用。為了保留樣品，IEX 要求樣品具有與固定相相反的極性電荷。鹽梯度 IEX 使用高濃度鹽來破壞這些離子的相互作用并洗脫分析物。pH 梯度必須跨越分析物的等電點(diǎn) ( pI )，以便蛋白質(zhì)在電中性時被洗脫。盡管線性 pH 梯度難以重現(xiàn)，但 pH 梯度可以將分析物

聚集到較窄的譜帶中，從而獲得比鹽梯度更高的分離度。由于必須非常精確地控制并適當(dāng)?shù)剡x擇流動相 pH、離子強(qiáng)度和梯度組分，可靠的 IEX 方法開發(fā)具有挑戰(zhàn)性。通常需要進(jìn)行大量的方法開發(fā)，但可以利用軟件來篩選僅由少量儲備液制備的復(fù)合緩沖系統(tǒng)的梯度，從而簡化方法開發(fā)。

毛細(xì)管等電聚焦 ( cIEF ) 也常用于電荷異構(gòu)體分析。類似于 pH 梯度 IEX，cIEF 也是基于 pI 進(jìn)行蛋白質(zhì)異構(gòu)體分離，是一項驗(yàn)證 IEX 結(jié)果的常用技術(shù)。