定量PCR還是數(shù)字PCR?

隨著數(shù)字PCR技術(shù)應(yīng)用的展開，越來越多實(shí)驗(yàn)室被其絕對(duì)定量的方式、結(jié)果的高靈敏度、高重復(fù)性等特質(zhì)所吸引。2012年年底，由Frost & Sullivan公司在北美市場(chǎng)進(jìn)行的調(diào)研顯示，約三分之一的被訪者表示會(huì)考慮購(gòu)買數(shù)字PCR設(shè)備。

　　那么，是否意味著目前在研究、臨床和工業(yè)領(lǐng)域內(nèi)，廣泛采用的熒光定量PCR技術(shù)將被淘汰?數(shù)字PCR很快就要將其徹底取代?越來越多實(shí)驗(yàn)室類似問題。結(jié)合多年推廣定量PCR與近幾年投身數(shù)字PCR領(lǐng)域的經(jīng)驗(yàn)心得，談?wù)勛约旱捏w會(huì)，供大家參考。

　　總體的觀點(diǎn)是：雖然絕大多數(shù)定量PCR的應(yīng)用都可以使用數(shù)字PCR完成，但在可預(yù)期的將來，兩者將長(zhǎng)期共存。到底使用定量PCR還是數(shù)字PCR，取決于具體應(yīng)用和對(duì)數(shù)據(jù)的要求。兩者不是either/or的關(guān)系，而是both/and的關(guān)系。兩種技術(shù)平臺(tái)各自的特點(diǎn)與現(xiàn)狀大致可從下面8個(gè)方面說明。

　　1. 在20多年的使用和發(fā)展中，定量PCR作為一種技術(shù)平臺(tái)，已經(jīng)產(chǎn)出海量的數(shù)據(jù)，在工業(yè)界和分子檢測(cè)的某些應(yīng)用上，定量PCR已經(jīng)成為“金標(biāo)準(zhǔn)”?；A(chǔ)研究方面，則形成了被稱為MIQE的“定量PCR標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)指南”。

　　2. 在定量PCR的各種應(yīng)用中，基因表達(dá)分析(gene expression analysis)的應(yīng)用比重約占七成，綜合各種因素來看，眼下定量PCR還是進(jìn)行基因表達(dá)研究的理想手段。

　　3. 上述的“各種因素”具體展開，主要包括：通量、自動(dòng)化程度、各種檢測(cè)探針與染料、檢測(cè)通道、成本和可參考文獻(xiàn)與protocol的數(shù)目等等。

　　4. 就目前市場(chǎng)上已有的數(shù)字PCR設(shè)備來看，定量PCR在檢測(cè)的線性范圍上具有優(yōu)勢(shì)，意味著同一個(gè)run內(nèi)可對(duì)各種表達(dá)豐度的樣品進(jìn)行分析。

　　5. 目前定量PCR已經(jīng)能實(shí)現(xiàn)高通量樣品條件下的自動(dòng)化操作。

　　6. 數(shù)字PCR在單分子層面上的絕對(duì)定量，可以徹底擺脫對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的依賴而直接給出靶序列的拷貝數(shù)，提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果在批內(nèi)和批間的穩(wěn)定性，甚至能用來對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定標(biāo)。

　　7. 基于絕對(duì)定量的方式，數(shù)字PCR結(jié)果的高重復(fù)性和高精度可實(shí)現(xiàn)微小差異的基因表達(dá)分析，如等位基因的不平衡表達(dá)、單細(xì)胞基因表達(dá)分析、microRNA表達(dá)分析等等。所謂“微小差異”的標(biāo)準(zhǔn)一般而言是指表達(dá)水平的差異在2倍以內(nèi)。

　　8. 同等條件下，數(shù)字PCR在靈敏度方面擁有優(yōu)勢(shì)，使得該技術(shù)已成為腫瘤的液態(tài)活檢、病原微生物檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因成分測(cè)定、宿主殘留DNA分析等的熱門技術(shù)。

　　最后，我們來聽聽MIQE的作者之一：比利時(shí)Ghent University的Jo Vandesompele教授如何評(píng)價(jià)定量PCR和數(shù)字PCR之間的關(guān)系：

　　To those who say dPCR will replace the “very reliable” qPCR, he responds: “of course not.” Digital PCR, however, might be right for some applications such as detection of rare mutations or copy-number variants.

　　He believes that qPCR is the “technology of choice” for gene expression-based experiments, particularly measuring gene expression changes of more than twofold, which probably make up the majority of experiments. In those instances, “qPCR can do the job” and at a lower price point that dPCR, he says. But spotting gene expression differences among similar molecules such as splice variants or microRNAs might work better with dPCR.