新一代測序(NGS)徹底改變了基因組學(xué)研究，并且在臨床中也起著至關(guān)重要的作用。 在評估新藥物治療方面，以 NGS 為基礎(chǔ) 的檢測也是越來越重要。同時也越來越多地用于篩選，診斷，癌癥分子表征及其他疾病的研究，這些分子病理工具的發(fā)展導(dǎo)致了個 性化治療和預(yù)防性治療 .1,2 而實驗室進(jìn)行高通量測序需要依靠高品質(zhì)的試劑以獲得最佳結(jié)果。水是 NGS 工作流程中必不可少卻經(jīng) 常被忽視的試劑。從系統(tǒng)清洗到基因測序，NGS 工作流程中的各種環(huán)節(jié)都需要不同級別的水。 現(xiàn)如今各種 NGS 平臺依賴于不同的化學(xué)過程和測序步驟，但大多數(shù)都遵循類似的實驗流程(圖 1)。 水質(zhì)可能影響實驗流程的每 一環(huán)節(jié)。 Figure 1.NGS 流程和水質(zhì)需求 DNA 片段化 高質(zhì)量的測序文庫對于獲得可靠的 NGS 數(shù)據(jù)至關(guān)重要 3，重要的第一步是 DNA 片段化 如果使用聲剪切或超聲處理來分離 DNA， 對于水浴用水建議使用無顆粒的純水(例如，Elix? 系統(tǒng))，因為雜質(zhì)會影響轉(zhuǎn)移到樣品的能量效率。 應(yīng)定期更換水以限制細(xì)菌生 長并降低樣品污染的風(fēng)險。 核酸庫制備 水含有的污染物，即使非常微量也可能直接干擾 DNA 或與在文庫制備期間進(jìn)行的酶反應(yīng)(例如終端修復(fù)，連接，PCR)。酶活性 可能受到水中痕量的有機(jī)分子(腐殖酸)，離子或金屬(鎂，鐵等)的影響。此外，核酸酶可能降解樣品，也需要避免。再者，水 中如顆粒或細(xì)菌的污染可能會污染儀器或沉積在自動化液體處理系統(tǒng)中。因此，推薦使用不含核酸酶的超純水(例如，來自裝有Biopak? 的 Milli-Q? 系統(tǒng))。 對于文庫定量和質(zhì)量控制，會使用凝膠，芯片或毛細(xì)管電泳。在所有情況下，水質(zhì)會影響帶有電荷的樣品的遷移，熒光檢測也可能 被有機(jī)污染物干擾。因此，為了確保結(jié)果的可靠，應(yīng)使用不含離子和有機(jī)物的超純水(電阻率 18.2MΩ?cm; TOC 5ppb 以下)， 用于緩沖液制備和毛細(xì)管凝膠，溶液稀釋。 Next-Generation Sequencing 測序過程對任何核酸酶活性都非常敏感。 雖然核酸酶污染的影響在初始加載和校準(zhǔn)期間可能不明顯，但隨著時間的推移，信號的 劣化會給實驗帶來災(zāi)難性的結(jié)果。 因此，推薦使用無核酸酶的超純水，用于緩沖液的稀釋和系統(tǒng)運行緩沖液的配制。 ? 基于熒光的 NGS NGS 平臺在工程和測序化學(xué)方面有所不同，但大部分依賴于熒光檢測。除了上述水中污染物外，必須避免痕量有機(jī)污染物，它 們可能會影響熒光檢測。事實上，水中的有機(jī)污染物可以淬火或增加熒光信號，這兩種情況都會產(chǎn)生錯誤的結(jié)果。 ? 離子半導(dǎo)體 NGS 該測序技術(shù)通過檢測核苷酸摻入過程中的質(zhì)子釋放 5，它不同于光學(xué)檢測，而是通過精確的 pH 中的電荷變化來進(jìn)行測量。該技 術(shù)對于不是由于 DNA 分子擴(kuò)展而導(dǎo)致的任何 pH 變化非常敏感。儀器制造商特別建議使用新鮮純化的超純水確保 pH 接近 7。 這是因為儲存中超純水在與大氣接觸后會吸收二氧化碳并變成微酸性(圖 2)，會影響測序過程。對于這個原因，用于離子半導(dǎo) 體 NGS 檢測的超純水必須經(jīng)過新鮮的純化和保存，以免與大氣接觸。 Figure 2. Absorption of carbon dioxide by ultrapure water. When ultrapure water is left in contact with the atmosphere, it absorbs carbon dioxide from the air, leading to the production of carbonic acid, carbonate and bicarbonate. The pH of water, initially at 7.0, may drop as low as 5.8. 水是 NGS 中的重要試劑，其質(zhì)量直接影響了測序結(jié)果的一致性和可靠性。設(shè)計優(yōu)良和維護(hù)穩(wěn)定的水純化系統(tǒng)可以為實驗室提供高 品質(zhì)的水，以滿足他們所有實驗的需求。 References 1. I.A. Cree, Z. Deans, M.J.L. Ligtenberg, et al., Guidance for laboratories performing molecular pathology for cancer patients, J Clin Pathol (2014) 67:923-931. 2. T.J.R. Harris, F. McCormick, The molecular pathology of cancer, Nat. Rev. Clin. Oncol. (2010) 7, 251–265. 3. S.R. Head, H.K. Komori, S.A. LaMere et al., Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges, Biotechniques, (2014) 56(2):61-77. 4. E. Riche, S. Mabic, Nuclease-free water at your fingertips, Merck Lab Water Application Note, 2017. 5. E.R. Mardis, Next-Generation Sequencing Platforms, Annu. Rev. Anal. Chem. (2013) 6:287–303.
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