項目成果在國家自然科學基金項目(批準號：32025009、91940306、31722031)等資助下，中國科學院北京生命科學研究院趙方慶研究員團隊開發(fā)了一種高效測定分析環(huán)形RNA的方法,相關成果以“利用納米孔測序和CIRI-long技術對環(huán)狀RNA進行綜合分析(Comprehensive profiling of circular RNAs with nanopore sequencing and CIRI-long)”為題，于2021年3月11日以長文形式在《自然 生物技術》(Nature Biotechnology)上在線發(fā)表。 　　環(huán)形RNA是一類在真核生物中廣泛存在的、具有特殊環(huán)狀結構的RNA分子。近期多個研究發(fā)現，環(huán)形RNA不僅發(fā)揮miRNA海綿、RBP海綿以及翻譯短肽等生物學功能，而且通過結合蛋白分子，參與天然免疫等生理過程發(fā)揮重要功能。而確定環(huán)形RNA的全長序列，是進行環(huán)形RNA功能研究的重要基礎。目前的研究方法對于環(huán)形RNA結構的識別能力主要被二代測序的讀長所限制，對于長度較長(>500bp)的環(huán)形RNA分子，仍然缺少有效的全長重構手段。
 　　趙方慶團隊首先測試了不同實驗條件對環(huán)形RNA的富集效果，進而對環(huán)形RNA建庫流程進行優(yōu)化，并通過使用poly(A) tailing提升RNase R對環(huán)形RNA的富集效率。最后應用納米孔測序技術，實現了對目標環(huán)形RNA的全長序列進行直接測定。基于上述實驗流程，趙方慶團隊進一步開發(fā)了用于識別納米孔測序數據中環(huán)形RNA序列的CIRI-long算法。CIRI-long將一致性序列比對到參考基因組，對其中的反向剪接位點和內部結構進行識別，并基于基因注釋和剪接信號信息，提供單一樣本內和多樣本間結果的整合與校正方法(圖1)，從而實現環(huán)形RNA的準確識別和全長重構。
 　　與傳統(tǒng)的二代測序方法相比，CIRI-long方法大幅提升了環(huán)形RNA全長重構能力，并可實現與二代測序相近的分析成本。同時，CIRI-long提供了樣本間整合分析的工具，并針對納米孔測序的高錯誤率建立了有效校正方法，為環(huán)形RNA的功能研究提供了重要的方法學工具，具有很高的應用價值。
 圖1：  環(huán)形RNA全長重構的實驗與計算流程