摘 要：

  USP 787和USP788描述了治療用蛋白質(zhì)和醫(yī)用注射液中怎樣測量肉眼不可見的顆粒物。大部分這類藥物是通過預(yù)充式注射器進(jìn)行包裝。這些注射器里都有硅油，因?yàn)楣栌涂梢越档妥⑸渌幬飼r注射器的阻力。這些硅油形成的乳滴在用顯微鏡方法進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)的時候會造成一定的誤差。本文主要通過使用AccuSizer 780SIS研究這些硅油滴在蛋白質(zhì)注射液計(jì)數(shù)方面的影響。

簡 介：

 注射藥物顆粒物的檢測主要包括肉眼可見和不可見兩個方面。對于肉眼不可見的檢測主要是通過液體顆粒計(jì)數(shù)或者顯微鏡兩種方法來完成。后文中提到的檢測過濾前后的粒子數(shù)量，主要是為了排除由于注射器中螺帽，機(jī)筒和活塞本身帶來的額外的粒子影響。盡管和纖維，金屬碎片等外來污染物相比，注射器中這些硅油粒所造成的安全危害較小，但是他們也可以通過液體顆粒計(jì)數(shù)來監(jiān)測。并且預(yù)充式注射器內(nèi)部的硅油乳粒會帶來大量不同大小的顆粒。

材料介紹：

  注射器：實(shí)驗(yàn)中用到的注射器是來自 BD PosiFlush Normal Saline Syringe, 10 mL, Ref no. 306546 如圖1.硅潤滑油：醫(yī)用的硅潤滑油應(yīng)用到注射器的螺帽，機(jī)筒和內(nèi)壁，使得注射器可以更好的推動。

  本文測量了鹽水和鹽水與蛋白質(zhì)混合后在注射器中顆粒的變化。

  蛋白質(zhì)：Athens Research Technology, Immunoglobin G, Human Plasma, Lot no. IG2014-02, Cat no. 16-16-090707, lyophilized（凍干） from 22.4 mL 20 mM phosphate buffer（磷酸鹽緩沖液）, pH 7.4, w/ 150 mM NaCal 0.05% sodium azide（疊氮化鈉）.蛋白質(zhì)在PBS(聚丁二酸丁二醇酯)中進(jìn)行分散;磷酸鹽緩沖藥品，Sigma Aldrich P4417-50TAB。

方法學(xué)：

 首先通過對注射器的粒子進(jìn)行測量，沒有進(jìn)行過任何以下激活處理包括沒有插入AccuSizer的樣品管或者沒有移除機(jī)筒并將其倒入一個干凈的燒杯或者推動活塞進(jìn)入一個干凈的燒杯。

  lgG蛋白用過濾的PBS溶液配成0.1mg/ml的溶液。用移液槍取0.5ml的溶液加入到包含過濾后的PBS溶液和食鹽水中的10ml注射器中。使用AccuSizer儀器取1ml的樣品不稀釋直接測量，重復(fù)測三次檢查重復(fù)性。

檢測儀器：

  AccuSizer FX Nano SIS 儀器擁有兩個傳感器LE-400;0.5μm-100μm和FX Nano;0.15μm-10μm，如圖2所示。AccuSizer SIS取樣器可將進(jìn)樣量準(zhǔn)確的下調(diào)至100μl。AccuSizer FX Nano SIS是僅有一個注射進(jìn)樣器和兩個傳感器，并沒有增加檢測器或者電腦的數(shù)量。

結(jié)果討論：

  從24個注射器中隨機(jī)的選擇了8個注射器。其中4個用只有LE400的傳感器進(jìn)行分析同時沒有推動活塞，具體結(jié)果如圖3所示，另外四個則將通過活塞將樣品推到一個干凈的燒杯中，如圖4所示。橫坐標(biāo)X用來表示粒子的大小，縱坐標(biāo)表示粒子的濃度 粒子數(shù)量/ml。

討 論：

  實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的目的是期望通過推動活塞進(jìn)入到燒杯中會因?yàn)楣栌腿榱５拇嬖诙沟妙w粒濃度有一定的增加。兩個沒有激活的樣品在圖標(biāo)3可以看出大于0.5μm的粒子濃度約為10,000個/ml，另外的兩個大于0.5μm的粒子濃度在20,000個/ml。激活的四個樣品大于0.5μm的粒子濃度大約在16,000個/ml和28,000個/ml。說明注射器中硅油的存在會增加。 

蛋白質(zhì)的測量結(jié)果：

   USP787是用來描述治療用蛋白質(zhì)，同時USP788對于理想結(jié)果的判定通過標(biāo)準(zhǔn)是10μm和25μm，但是FDA建議檢測更小的蛋白質(zhì)粒子，這樣才能給出更好的標(biāo)準(zhǔn)關(guān)于檢測蛋白質(zhì)聚集的標(biāo)準(zhǔn)。

   三個激活的鹽水的樣品和分散在PBS里的lgG蛋白樣品通過包含兩個傳感器的AccuSizer FX Nano SIS進(jìn)行測量，結(jié)果如圖5和圖6。之后這蛋白質(zhì)被過濾后額PBS（blue）：鹽水=2：1的混合液進(jìn)行稀釋，具體結(jié)果如圖7。

討 論：

 可以從圖5看出，注射器和注射器中由于硅油滴的存在引起的粒子數(shù)量的變化在更小的范圍被發(fā)現(xiàn)。同時說明不同的注射器里硅油所造成的粒子數(shù)目也有區(qū)別。

 AccuSizer 780 FX Nano SIS儀器可以對0.2μm-0.5μm的粒子進(jìn)行計(jì)數(shù)，因?yàn)樗臋z測下限可以降到0.15μm。這種新的對于小粒子的敏感性的技術(shù)正在尋找其他領(lǐng)域的應(yīng)用，它可以很好的應(yīng)用到蛋白質(zhì)的檢測中了，如圖6所示的蛋白質(zhì)分散在過濾后的PBS溶液和圖7所示的蛋白質(zhì)和鹽水混合的溶液?？梢悦黠@的區(qū)分出在鹽水和蛋白質(zhì)溶液中的粒子大小和數(shù)目。

結(jié) 論：

 AccuSizer 780 FX Nano SIS符合所有關(guān)于USP787和788的檢測要求。同時對于分析不可見的粒子是最好的選擇，因?yàn)樗臋z測下線可以精確到0.15μm，最小的檢測樣品量可以低到100μl。這種低量程的計(jì)數(shù)工具為實(shí)驗(yàn)提供更多有趣的結(jié)果，特別是可以幫助研發(fā)人員更好的在研究治療和注射用的蛋白質(zhì)聚集的問題。這種獨(dú)特的技術(shù)為AccuSizer 780 FX Nano SIS提供了其他顆粒檢測儀器所不具備的能力。它不僅是一個液體顆粒計(jì)數(shù)器還是一個粒度儀。

參考文獻(xiàn)：

1. USP 787, Subvisible particulate matter in therapeutic protein injections;

2. USP 788, Particulate matter in injections;

3. PSS Application：Protein Aggregation, available at www.pssnicomp.cn .