目的基因不能直接整合到大多數(shù)真核細胞，常用的手段是將目的基因包裝成病毒來感染

細胞，從而得到表達滿足實驗需求。

1、病毒的種類

病毒有很多種，常見的有慢病毒和腺病毒

1.1 慢病毒

1.1.1 原理

慢病毒（Lentivirus）是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種。構(gòu)建的 siRNA / miRNA 慢病毒載體，與

化學合成的 siRNA 和基于瞬時表達載體構(gòu)建的普通 siRNA 載體相比，一方面可以擴增替

代瞬時表達載體使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆經(jīng)過慢病毒包裝系統(tǒng)包裝后，可

用于感染依靠傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑難于轉(zhuǎn)染的細胞系如原代細胞、懸浮細胞和處于非分裂狀態(tài)的細

胞，并且在感染后可以整合到受感染細胞的基因組，進行長時間的穩(wěn)定表達。

1.1.2 特點

1） 直接包裝成為假病毒顆粒，對分裂和非分裂細胞均有感染作用，適合 RNAi 研究和體

內(nèi)實驗中難于轉(zhuǎn)染的細胞 (比如神經(jīng)元細胞、干細胞或其它原代細胞)。

2） 可以通過簡單方式，在短時間內(nèi)獲得穩(wěn)定表達特定基因的多種細胞株。

3） 可用于基因敲除、基因治療和轉(zhuǎn)基因動物研究。

4） 無需任何轉(zhuǎn)染試劑，操作簡便。

5） 可以根據(jù)客戶需要制備多種標記。

1.1.3 慢病毒包裝簡要流程：

1） 含有目的基因的慢病毒 RNAi 干擾載體的構(gòu)建和質(zhì)粒純化提取。

2） 慢病毒載體，包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染病毒包裝細胞 293T 等。3） 培養(yǎng) 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培養(yǎng)液。

4） 病毒的純化和濃縮。

5） 分裝、- 80 ℃保存。

6） 滴度測定目的基因檢定，并出具檢測報告。

1.2、腺病毒

1.2.1 原理

腺病毒(Adenovirus，Ad)是一種無包膜的線狀雙鏈 DNA 病毒，其復(fù)制不依賴于宿主

細胞的分裂。有近 50 個血清型，大多數(shù) Ad 載體都是基于血清型 2 和 5，通過轉(zhuǎn)基因的方

式取代 E1 和 E3 基因，降低病毒的復(fù)制能力。這些重組病毒僅在高水平表達 E1 和 E3 基因

的細胞中復(fù)制，因此是一種適用于治療的高效控制系統(tǒng)。

1.2.2 特點

1） 幾乎可以感染所有類型的細胞

2） 可以獲得復(fù)制缺陷型 (E1 和 E3 缺失) 的腺病毒

3） 病毒滴度高，產(chǎn)生病毒經(jīng)過濃縮后可以達到 1012 PFU/mL，能有效的進行增殖。

4） 腺病毒載體感染宿主的范圍比較廣，制備容易，操作簡單.

5） 感染細胞時，不整合到染色體中，不存在激活致癌基因或插入突變等危險，生物安全

性高。

1.2.3 腺病毒包裝簡要流程

1） 構(gòu)建表達 siRNA/miRNA 的腺病毒載體

2） 采用 PacI 消化純化的質(zhì)粒。

3） 消化好的腺病毒表達載體轉(zhuǎn)染 293A 細胞，收獲細胞以制備病毒粗提液。

4） 將病毒粗提液感染 293A 細胞以擴增病毒。5） 分裝，-80℃保存。

1.3、慢病毒和腺病毒的比較

慢病毒載體系統(tǒng)和腺病毒載體系統(tǒng)比較

病毒表達系統(tǒng)

慢病毒表達系統(tǒng)（Lentivirus）

腺病毒表達系統(tǒng)（Adenovirus）

病毒基因組

RNA 病毒

雙鏈 DNA 病毒

復(fù)制

自主復(fù)制

自主復(fù)制

是否整合

病毒基因組整合于宿主基因組，長時

間、穩(wěn)定表達外源基因

病毒基因組游離于宿主基因組外，瞬

時表達外源基因

感染細胞類型

感染分裂和不分裂細胞，適用于難轉(zhuǎn)

染的原代細胞（如神經(jīng)細胞）及體內(nèi)

實驗

感染分裂和不分裂細胞

表達風度

中水平表達

高水平表達

表達時間

慢（1-3 天）

快（1-2 天）

滴度

滴度zui高可達 10*8pfU/ml

滴度zui高可達 10*11pfU/ml

克隆容量

可插入不超過 8kb 的外源片段，滴度

隨插入片段長度增加而降低

可插入高達 8kb 的外源片段，滴度隨

插入片段長度增加而降低

免疫原性

低免疫原性

高免疫原性2、構(gòu)建目的基因到載體

2.1 構(gòu)建手段

一般是根據(jù)原始質(zhì)粒信息確定克隆方案，有以下兩種手段。

1）如果原始質(zhì)粒與載體有匹配酶切位點，采用相應(yīng)的內(nèi)切酶切下相應(yīng)片段，回收并連接到

載體，酶切，并測序鑒定

2）如果沒有匹配的酶切位點，則設(shè)計帶有特殊接頭的引物進行 PCR 擴增，得到目的片段，

采用相應(yīng)的內(nèi)切酶切下相應(yīng)片段，回收并連接到穿梭載體，酶切，并測序鑒定

2.2 質(zhì)粒載體

2.2.1 概念

能夠進行自主復(fù)制的環(huán)狀 DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)，包括真核生物的細胞器（主要指線粒體和葉

綠體）中和細菌細胞擬核區(qū)以外的環(huán)狀脫氧核糖核酸(DNA)分子

2.2.2 特征

質(zhì)粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四環(huán)素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些質(zhì)

粒稱為附加體(episome)，這類質(zhì)粒能夠整合進真菌的染色體，也能從整合位置上切離下來

成為游離于染色體外的 DNA 分子。質(zhì)粒在宿主細胞體內(nèi)外都可復(fù)制。通過個些特性，人們

可以把一些目的 DNA 片斷構(gòu)建在質(zhì)粒中，通過轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，利用選擇培養(yǎng)基來篩選

從而不斷的復(fù)制，來得到目的產(chǎn)物。3、質(zhì)粒 DNA 在大腸桿菌里轉(zhuǎn)化

連接上目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌是為了讓目的基因在大腸桿菌里擴增，然后提取質(zhì)

粒，以下是質(zhì)粒 DNA 在大腸桿菌里轉(zhuǎn)化的三步驟。

3.1 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備

1）從大腸桿菌平板上挑取一個單菌落于 3mlLB 培養(yǎng)基的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。

2）取 0.4ml 菌液轉(zhuǎn)接到 40mlLB 液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng) 2~3h

3）菌液轉(zhuǎn)移到 50ml 離心管中，冰上放置 10min

4）4℃離心 10min（4000r/min）

5）倒出培養(yǎng)液，將管口倒置以便培養(yǎng)液流盡

6）用冰浴的 0.1mol/L 氯化鈣 10ml 懸浮細胞沉淀，立即冰浴 30min

7）4℃離心 10min（4000r/min）

8）倒出上清液，用冰浴的 0.1mol/L 氯化鈣 2ml 懸浮細胞（冰上放置）

9）分裝細胞，200ul 一份，4℃保存

3.2 質(zhì)粒 DNA 的轉(zhuǎn)化

1）取 200ul 新鮮制備的感受態(tài)細胞，加入質(zhì)粒 DNA2ul 混勻，冰浴 30min

2）離心管放到 42℃保溫 90s

3）冰浴 2min

4）每管加 800ulLB 液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng) 1h（150r/min）

5）取適當體積（100ul）的復(fù)蘇細胞，涂布在選擇性培養(yǎng)基上，正置 30min

6）倒置平皿 37℃，12~16h，出現(xiàn)菌落

3.3 質(zhì)粒提取步驟

1）取 1~4ml 在 LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的菌液，12000 轉(zhuǎn)離心 1min，棄上清2）加 250ul 溶液Ⅰ/RNaseA（溶液Ⅰ為細胞懸浮液）混合液，漩渦劇烈振蕩直至菌體完全

重新懸浮，室溫靜置 1-2min。

3）加入 250ul 溶液Ⅱ（細胞裂解液），輕柔的反復(fù)顛倒混勻 5-6 次。室溫放置 1-2min，使

菌體充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。

4）加入 350ul 溶液Ⅲ（中和液），立刻輕柔地反復(fù)顛倒混勻 5-6 次，此時會出現(xiàn)白色絮狀

沉淀。

5）12000 室溫離心 10min，收集上清。

6）將上清置于 DNA 純化柱中，靜置 1-2min。

7）12000 轉(zhuǎn)離心 1min，棄濾液。

8）加入 500ul 溶液 PB（洗滌液）12000 轉(zhuǎn)離心 1min，棄濾液，目的是將硅膠膜上吸附

的蛋白、鹽等雜質(zhì)洗脫，以獲得高質(zhì)量質(zhì)粒 DNA。

9）加入 500ul 溶液 W（去鹽液），12000 轉(zhuǎn)離心 1min，棄濾液，重復(fù)一次。

10）12000 轉(zhuǎn)離心 3min，以徹底去除純化柱中殘留的液體。

11）將 DNA 純化柱置于新的離心管中，懸浮滴加 50-100ul 溶液 Eluent（為無菌的雙蒸水，

PH 為 8.0-8.5），室溫放置 2min。

12）12000 轉(zhuǎn)離心 1min，此時管底即為高純度的質(zhì)粒 DNA，質(zhì)粒于-20℃保存。

質(zhì)粒提取步驟：吸取液體培養(yǎng)基于 1.5ml 離心管中 12000 轉(zhuǎn)離心 1min，棄上清，吸取培

養(yǎng)基重復(fù)離心棄上清離心，留取少量菌液作為菌種保存，可直接置于-20℃ 加

250ulBufferS1 懸浮細菌，懸浮均勻 加 250ulBufferS2 溫和充分的上下翻轉(zhuǎn) 4-6 次混

合均勻，使菌體裂解 加 350ulBufferS3 溫和上下翻轉(zhuǎn) 12000 離心 10min 取上清

液轉(zhuǎn)移到專用的制備管（2ml）12000 轉(zhuǎn)離心 1min，棄濾液 加 500ulBufferW112000轉(zhuǎn)離心 1min，棄濾液 加 500ulBufferW212000 轉(zhuǎn)離心 1min，棄濾液，重復(fù)一遍

將制備管置回 2ml 離心管 12000 轉(zhuǎn)離心 1min 將制備管移入新的 1.5ml 離心管中，

加 60~80ulEluent 或離子水，室溫 1min12000 轉(zhuǎn)離心 1min 移去制備管，將有質(zhì)粒

的離心管于 4℃或是-20℃保存4、質(zhì)粒 DNA 和其他包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 293T 細胞產(chǎn)生病毒（即病毒包裝）

4.1 名詞解釋

4.1.1293T 細胞是由 293 細胞派生, 表達 SV40 大 T 抗原的人腎上皮細胞系, 被廣泛應(yīng)用

于瞬時轉(zhuǎn)染以過表達各種目標蛋白, 或是用以包裝病毒。

4.1.2 脂質(zhì)體：某些細胞質(zhì)中的天然脂質(zhì)小體，可作為生物膜，用于捕獲外源性物質(zhì)后更有

效地運送到靶細胞，經(jīng)同細胞融合而釋放。

4.2 共轉(zhuǎn)染的操作步驟

第1天：用無抗生素 DMEM+10%FBS 鋪板 293FT 細胞，2ml/孔。確保第二天細胞密度達

到 80%-90%融合度

第二天：

1. 500ul 無血清培養(yǎng)基稀釋 2ug 表達質(zhì)粒+1.5ug psPAX2+1.5ug pMD2.G

2. 500ul 無血清培養(yǎng)基稀釋 15ul 脂質(zhì)體 2000

3. 5min 后，將 DNA 溶液和脂質(zhì)體溶液混合，室溫靜止 20min

4. 從 6 孔板中吸出 1ml 無血清培養(yǎng)基，然后滴加入 1ml 質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合物。

5. 6-10h 后，移除含有 DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)基，代之以正常培養(yǎng)液 DMED+10%FB

（從此刻開始算時間）。

第三天：

1.轉(zhuǎn)染 24h 后，熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染效率應(yīng)達到 70%以上

第四天：

1.轉(zhuǎn)染后 48 和 72h 分別收獲含病毒的上清。

2.3000 rpm 離心 20min，0.45um 濾膜過濾，去除細胞沉淀。

3.12000 轉(zhuǎn)離心濃縮細胞、分裝-80 C 貯存。4.滴度測定目的基因檢定，并出具檢測報告。

4.3 病毒包裝的原理

質(zhì)粒 DNA 為能轉(zhuǎn)錄出慢病毒遺傳物質(zhì)（RNA），但不能翻譯出慢病毒的外殼及蛋白成

分的載體質(zhì)粒，其同時連有目的基因和報告基因，psPAX2 為能表達慢病毒外殼的質(zhì)粒，其

表達產(chǎn)物可通過粘附機制更易穿過細胞膜， pMD2.G 為慢病毒的膜蛋白質(zhì)粒，通過

lipofectamine2000 進行三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)到靶細胞基因組中，宿主基因組在表達時，隨宿主基

因轉(zhuǎn)錄出的目的基因 RNA 與 psPAX2、pMD2.G 基因翻譯出的蛋白組裝為慢病毒。

在上述程序中提及的 第四天 收集病毒。在第五天再用該病毒感染靶細胞，病毒進入

細胞后，其遺傳物質(zhì) RNA 反轉(zhuǎn)錄出 DNA，該基因再整合到靶細胞的基因組中，完成轉(zhuǎn)染

過程，因為質(zhì)粒 DNA 只能轉(zhuǎn)錄出病毒 RNA 和表達目的基因卻不能表達出病毒的外殼和膜

蛋白成分，因此其不能像普通的病毒一樣在宿主細胞能反復(fù)增殖，故對宿主細胞是無害的并

且高效的將目的基因轉(zhuǎn)然到靶細胞基因組中。5、慢病毒感染細胞

5.1 流程圖

5.2 感染步驟

1）鋪板：將對數(shù)生長期的細胞消化重懸后，按 1*105/L 密度接種于 12 孔板，生長過夜

2）感染：將 70-80%鋪滿 12 孔板中的培養(yǎng)液吸除，換新鮮的培養(yǎng)液，同時加入 PBS 濃度

梯度稀釋的病毒液，混合均勻后即可放入孵箱培養(yǎng)。

3) 24h 左右可換液，48 小時即可看熒光，具體根據(jù)細胞狀態(tài)來看。

5.3 熒光顯微鏡的操作流程

打開熒光器（30min 內(nèi)不能關(guān)閉，否則影響顯微鏡壽命），細胞培養(yǎng)板置于載物臺，調(diào)

節(jié)物鏡和光圈，先用自然光觀察視野內(nèi)細胞，再關(guān)閉光，開啟熒光通道，觀察熒光強度，判

定感染率。圖片取樣前可以調(diào)節(jié)曝光時間，增益值和彩色度使熒光照片zui完美。（針對 leica）

5.4 注意事項內(nèi)容

1.病毒濃度要適宜，太少的話細胞被感染的也少，但是病毒濃度太大，對細胞有傷害。

2.感染病毒時培養(yǎng)基量少，以保證病毒的濃度，在培養(yǎng) 10h 左右可根據(jù)培養(yǎng)基顏色加培養(yǎng)

基。

3.在不明確細胞感染復(fù)數(shù)情況下，可進行濃度梯度感染，計算細胞感染復(fù)數(shù)。4.在加病毒后一般 24h 左右可換液，48 小時即可看熒光，具體時間根據(jù)細胞狀態(tài)來看。6、感染后的細胞檢測方法

6.1 熒光初步檢測

若有熒光，則表示病毒感染成功，但并不能確定目的基因是否整合到細胞中，待進一步

檢測，熒光有強弱之分，與病毒加入的量有關(guān)。

6.2RNA 的提取及 RT-PCR 檢測

6.2.1 原理

因為真核細胞 DNA 含有很多非編碼區(qū)，真核生物的 DNA 轉(zhuǎn)錄成為 RNA 之后，經(jīng)過

剪切和拼接，去掉這些非編碼區(qū)，才能形成真正的 mRNA，，是否表達真核生物的基因并表

達相應(yīng)的蛋白，只能通過提取其 mRNA 并 RT-PCR 這條途徑來測定

6.2.2RNA 提取步驟

加 1mlTrizol，吹打后移至 1.5ml 無菌的離心管中；加 100ul lv仿劇烈振蕩 30s 混勻，

12000 轉(zhuǎn) 15min，可看到明顯分層；取上層透明液體至新的 1.5ml 離心管中，加等體積的

異丙醇，混勻靜置 10min，12000 轉(zhuǎn)離心 10min，棄上清，加 1ml70%乙醇，12000 轉(zhuǎn)，

離心 10min，棄上清，風干剩余液體，zui后加 DEPC-水溶解 RNA，電泳，粗步判定 RNA

純度。

6.2.3RT-PCR 步驟：

RT 是一個逆轉(zhuǎn)錄的過程，用前一天提取好的總 RNA，在加入引物，模版和酶，并在 PCR

儀的溫度設(shè)置下，RNA 可逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA。

PCR 是 cDNA 在模版，引物，酶的作用下進行復(fù)制成雙鏈 DNA。（具體步驟省略）

6.3 蛋白提取及 Western 檢測

western-Bloting：蛋白免疫印跡（Western blotting 或 Immunoblotting）一般由

凝膠電泳、樣品的印跡和免疫學檢測三個部分組成。第1步是做 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，使待測樣品中的蛋白質(zhì)按分子量大小在凝膠中分成帶。 第二步把凝膠中已分成條帶的蛋白

質(zhì)轉(zhuǎn)移到一種固相支持物上， 用得zui多的材料是硝酸纖維素膜(NC 膜)和 PVDF 膜， 蛋

白轉(zhuǎn)移的方法多用電泳轉(zhuǎn)移 （轉(zhuǎn)移電泳） ，它又有半干法和濕法之分，現(xiàn)在大多用濕法。

第三步是用特異性的抗體檢測出已經(jīng)印跡在膜上的所要研究的相應(yīng)抗原。免疫檢測的方法可

以是直接的和間接的?，F(xiàn)在多用間接免疫酶標的方法，在用特異性的第1抗體雜交結(jié)合后，

再用酶標的第二抗體（堿性磷酸酶（AP）或辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗第1抗體的

抗體）雜交結(jié)合，再加酶的底物顯色或者通過膜上的顏色或 X 光底片上暴光的條帶來顯示

抗原的存在。該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于蛋白表達水平的檢測中。

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