電泳是一個(gè)很基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)，電泳圖譜是通過電泳將一個(gè)混合物樣品(如血清)在支持介質(zhì)上分成區(qū)帶。但須將電泳條經(jīng)過染色，使區(qū)帶顯示出來而得電泳圖譜。還可以進(jìn)一步在光密度計(jì)上進(jìn)行掃描而獲得記錄圖譜。跑電泳看似簡單，做塊膠，上個(gè)樣，插上電源，其實(shí)遠(yuǎn)沒有這么簡單。下面就給大家介紹下跑電泳及電泳圖譜繪制容易遇到的一些問題和解決辦法。

一、制作一塊優(yōu)質(zhì)的瓊脂糖凝膠

所謂“工欲善其事，必先利其器”，能否做一塊好的瓊脂糖凝膠，直接影響到后面的電泳和結(jié)果的分析。電泳的時(shí)候，會(huì)出現(xiàn)各種各樣奇怪的圖，給大家展示一下：

從圖一上看，DNA電泳時(shí)，DNA條帶好像遇到阻礙而發(fā)生了扭曲；圖二中DNA亮帶雖沒有發(fā)生扭曲，但是卻出現(xiàn)了雜斑亮帶。這是因?yàn)樵谥颇z時(shí)帶入了其它雜質(zhì)，形成了障礙物，使得DNA條帶電泳時(shí)受到阻礙無法繼續(xù)電泳，從而形成扭曲帶（如圖一）；或者是制膠時(shí)溶膠不完全以致瓊脂糖顆粒殘留，形成一些濃度較高的凝膠區(qū)域，在DNA電泳經(jīng)過這些區(qū)域時(shí)，部分DNA被阻礙在這里而形成不規(guī)則亮帶（如圖二）。

“工欲善其事，必先利其器”，能否做一塊好的瓊脂糖凝膠，直接影響到后面電泳和結(jié)果的分析。制膠前，給大家的建議是：

1. 在制膠時(shí)必須將制膠模具、梳子以及燒杯等物品洗凈，以免干膠及其他雜質(zhì)帶入；

2. 在溶膠時(shí)應(yīng)觀察溶液中是否有未溶解的瓊脂糖顆粒，確保溶膠完全；

3. 在溶液倒入制膠模具前必須充分混勻，以免制出來的膠出現(xiàn)不均勻的現(xiàn)象。

二、選擇合適濃度的瓊脂糖凝膠

除了以上這種低級問題，還有一個(gè)容易忽略的問題，那就是凝膠的濃度。建議長片段的DNA選用低濃度的凝膠電泳，短片段的DNA則選用高濃度的凝膠電泳。比如：

以上這兩幅電泳圖是用相同的DNA Ladder、上樣量、電泳電壓并且跑了一樣長的時(shí)間時(shí)，小新的內(nèi)心是崩潰的！?。樯恫顒e非常明顯？哪里不一樣呢？就是由于采用了不同濃度的凝膠電泳而導(dǎo)致的。那怎么選擇合適濃度的瓊脂糖凝膠呢？簡而言之，長片段的DNA選用低濃度的凝膠電泳，短片段的DNA則選用高濃度的凝膠電泳--具體參考方案參考下表：

三、選擇合適的核酸上樣量電泳

要想電泳跑出可見條帶的話，至少需要上樣50 ng，但是0.5 cm寬的梳子Z好不超過0.5μg的DNA量，因?yàn)樯蠘恿窟^多會(huì)造成加樣孔超載，從而導(dǎo)致拖尾或彌散，對于較長的DNA此現(xiàn)象更為明顯。另外，加樣量的多少還應(yīng)依據(jù)加樣孔的大小及DNA片段的長度而定，當(dāng)加樣孔大時(shí)，樣品上樣量應(yīng)相應(yīng)加大。

四、選擇合適的電壓電泳

通常情況下電壓越低，走出的電泳條帶越平整。低電壓電泳時(shí)，電泳緩沖液也不容易發(fā)燙，也能確保在電泳的過程中凝膠不會(huì)變形。當(dāng)然電壓太低，等待電泳結(jié)果的時(shí)間就會(huì)延長，綜合考慮，一般控制電泳電壓≤5V/cm，即可保證電泳條帶的清晰度。

圖七和圖八是同一樣本跑出的圖，但是出來的效果差別非常大，主要是因?yàn)殡娪緯r(shí)的電壓不同。電泳圖七由于電泳的電壓過大，導(dǎo)致電泳條帶都扭曲變形了(當(dāng)實(shí)驗(yàn)使用GoldView Ⅱ型核酸染色劑時(shí)差別更明顯）。通常情況下電壓越低，走出的電泳條帶越平整。低電壓電泳時(shí)，電泳緩沖液也不容易發(fā)燙，也能確保在電泳的過程中凝膠不會(huì)變形。當(dāng)然電壓太低，等待電泳結(jié)果的時(shí)間就會(huì)延長，綜合考慮，一般控制電泳電壓≤5V/cm，即可保證電泳條帶的清晰度。

五、選擇合適的電泳距離（控制電泳時(shí)間）

Z后的這兩幅圖是同一塊凝膠在電泳的不同時(shí)間段拍攝的電泳圖。大家有沒有覺得圖九的電泳條帶還行呢，有主帶，雖然有彌散、拖尾條帶，但是主帶還是很亮的。如果只是看有沒有核酸的話，差不多就蒙混過去了，但是如果你是想看DNA狀態(tài)或者是分離不同長度片段的DNA，那么必須多跑一會(huì)兒，這樣就有了圖十。圖十可以看出有基因組DNA、質(zhì)粒DNA以及RNA。

為什么差別那么大？這是因?yàn)閳D九電泳的時(shí)間短，不同長度片段的DNA條帶還未分離，都聚集在一起，所以只能看見DNA含量Z高的主帶；而圖十的電泳時(shí)間比較長，不同長度片段的DNA條帶已經(jīng)分離，可以清晰看到不同長度片段的DNA條帶，甚至兩Z下方的兩條RNA條帶都被分離開了。

當(dāng)然對于一些片段的DNA，電泳20-30min家常便飯，有的甚至需要更長的時(shí)間，如果想稍微快一點(diǎn)，可以選用濃度比較稀的凝膠或稍微調(diào)高一點(diǎn)電壓進(jìn)行電泳，但是要有一定的范圍

六、電泳圖譜繪制與分析

根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠薄片上蛋白質(zhì)電泳帶的粗細(xì)、深淺和遷移率，繪制電泳圖譜，并計(jì)算相似率。

(一)遷移率計(jì)算

遷移率=(起點(diǎn)至蛋白帶的距離/起點(diǎn)至指示劑前沿線的距離)×.

其中起點(diǎn)系指加樣一端分離膠的起點(diǎn)線，指示劑前沿線指電泳結(jié)束時(shí)溴酚蘭指示劑在膠板另一端形成的藍(lán)色線。例如，某蛋白帶的遷移距離是3cm，起點(diǎn)至指示劑前沿線距離是10cm，則該蛋白帶的遷移率為0.3。比較兩個(gè)菌株間的相似性時(shí)，遷移率差異小于0.03的兩條蛋白帶被視為相似的蛋白帶。

(二)菌株間的相似率計(jì)算

相似率=(兩菌株相似蛋白帶的數(shù)目/兩菌株蛋白帶的總數(shù))×.

例如，兩個(gè)菌株間遷移率相似的蛋白帶有5對(10條)，兩菌株蛋白帶總數(shù)為15條，則這兩個(gè)菌株的相似率為67。相似率越高，菌株間的相似性越大。通常，同一個(gè)疫霉種菌株間的可溶性菌體蛋白質(zhì)電泳圖譜相似率在75~100之間。

為了提高蛋白質(zhì)電泳結(jié)果的準(zhǔn)確性，每一塊膠板應(yīng)同時(shí)用已知標(biāo)準(zhǔn)菌株與供試菌株一起電泳作為對照

2018-06-20 51795 熱門標(biāo)簽： 凝膠電泳血紅蛋白電泳毛細(xì)管電泳質(zhì)粒電泳電泳涂裝 上一篇 下一篇