文章譯自浙江大學(xué)蔡圣老師團(tuán)隊(duì)發(fā)表于Journal of Pharmaceutical Analysis（JPA）期刊的一篇綜述。原標(biāo)題為：《Recent advances and perspectives of nucleic acid detection for coronavirus》

新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）引起的肺炎暴發(fā)對(duì)全球公共衛(wèi)生構(gòu)成了巨大威脅。因此建立快速的標(biāo)準(zhǔn)診斷測(cè)試以檢測(cè)傳染?。–OVID-19），防止繼發(fā)性傳播尤為重要。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）被視為具有高靈敏度和特異性的病毒和細(xì)菌感染分子診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。等溫核酸擴(kuò)增因?yàn)槠湓诤銣貤l件下無(wú)需熱循環(huán)儀即可快速操作的基本優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是一種非常有前途的候選方法。這篇綜述總結(jié)了目前可用于冠狀病毒核酸的檢測(cè)方法，有助于研究人員和臨床醫(yī)生開(kāi)發(fā)更好的技術(shù)，以及時(shí)有效地檢測(cè)冠狀病毒感染。

1 基于PCR的方法

PCR是一種酶學(xué)方法，可通過(guò)分離包含基因片段的兩條DNA鏈，用引物標(biāo)記其位置，并使用DNA聚合酶在每個(gè)片段旁邊組裝一個(gè)拷貝并連續(xù)復(fù)制這些拷貝來(lái)產(chǎn)生基因的多個(gè)拷貝，該技術(shù)被廣泛用于擴(kuò)增微量生物材料。由于它的高靈敏度和高序列特異性，基于PCR的方法已成為用于檢測(cè)冠狀病毒常規(guī)和可靠的技術(shù)。通常操作是，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄將冠狀病毒RNA轉(zhuǎn)移到cDNA中，然后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后通過(guò)特定的檢測(cè)方法或儀器檢測(cè)PCR產(chǎn)物。在這些中，凝膠可視化和測(cè)序是PCR技術(shù)之后用于檢測(cè)冠狀病毒方法，然而，由于其過(guò)程耗時(shí)且成本較高，這些方法在臨床樣品中并不常用。

實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）技術(shù)目前被冠狀病毒檢測(cè)所青睞，因?yàn)樗哂刑禺愋詮?qiáng)，簡(jiǎn)便進(jìn)行定量分析的優(yōu)勢(shì)。此外，在早期，實(shí)時(shí)RT-PCR比常規(guī)RT-PCR測(cè)定法能夠診斷出更多感染者。因此，實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定法仍然是一個(gè)主要的方法被應(yīng)用于檢測(cè)各種冠狀病毒的檢測(cè)。

盡管RT-PCR已經(jīng)在本次戰(zhàn)“疫”中大顯身手，但科學(xué)界依然投入大量精力來(lái)改進(jìn)實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)。因?yàn)镽T-PCR方法容易受到污染，并且樣品處理和PCR后數(shù)據(jù)分析耗時(shí)。因此，van Elden等描述了基于TaqMan的實(shí)時(shí)RT-PCR，可以在常規(guī)診斷設(shè)置中輕松實(shí)現(xiàn)HCoV的檢測(cè)。此外，為了進(jìn)一步提高靈敏度，Yip等人使用2個(gè)TaqMan探針代替1個(gè)探針設(shè)計(jì)了SARS-CoV的實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析。使用雙TaqMan探針進(jìn)行定量的這種簡(jiǎn)單修飾方法在需要超敏性的領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，SARS-CoV檢測(cè)限為每個(gè)反應(yīng)1個(gè)拷貝RNA。

在臨床檢測(cè)中，缺乏安全和穩(wěn)定的外部陽(yáng)性對(duì)照（EPC）可能成為冠狀病毒診斷中的嚴(yán)重問(wèn)題，該問(wèn)題已引起了廣泛關(guān)注。Yu等開(kāi)發(fā)了一種實(shí)時(shí)RT-PCR分析，其中裝甲R(shí)NA被用作EPC來(lái)檢測(cè)SARS-CoV，檢測(cè)極限為10拷貝/ L。同時(shí)，冠狀病毒的快速突變性質(zhì)凸顯了對(duì)準(zhǔn)確檢測(cè)遺傳多樣性冠狀病毒的需求。因此，為了提高精確檢測(cè)冠狀病毒的能力并降低由基因組序列變異引起的假陰性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)，研究人員建立了多重實(shí)時(shí)RT-PCR方法，對(duì)冠狀病毒的多靶點(diǎn)檢測(cè)具有良好的敏感性。Hadjinicolaou等使用耐錯(cuò)配的分子信標(biāo)開(kāi)發(fā)了實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定法，以區(qū)分致病菌株和非致病菌株。該測(cè)定法包含四個(gè)信標(biāo)，除了內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照外，還靶向四個(gè)基因。它已使用臨床樣品進(jìn)行了驗(yàn)證，該樣品具有目標(biāo)檢測(cè)能力和特異性，每個(gè)反應(yīng)的檢測(cè)極限為5個(gè)拷貝。

2 基于核酸等溫?cái)U(kuò)增的方法

2.1 基于常規(guī)的LAMP方法

LAMP是高效的新型等溫核酸擴(kuò)增方法。它通常用于DNA和RNA的擴(kuò)增，由于其指數(shù)擴(kuò)增特性，且分別由4種不同的引物同時(shí)鑒定的6個(gè)不同的靶序列而顯示出很高的靈敏度和高特異性。另一方面，LAMP技術(shù)測(cè)定快速且不需要昂貴的試劑或儀器，因此，LAMP檢測(cè)的應(yīng)用可能有助于降低檢測(cè)冠狀病毒的成本。目前，很多企業(yè)已經(jīng)開(kāi)發(fā)了基于LAMP的冠狀病毒檢測(cè)方法并將其應(yīng)用于臨床診斷。

凝膠電泳通常用于分析擴(kuò)增產(chǎn)物以進(jìn)行終點(diǎn)檢測(cè)。潘等人報(bào)告了一種用于SARS診斷的簡(jiǎn)單LAMP檢測(cè)方法，并證明了使用該技術(shù)檢測(cè)SARS-CoV的可行性。選擇SARS-CoV的ORF1b區(qū)域用于SARS診斷，并在6個(gè)引物的存在下通過(guò)LAMP反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，然后通過(guò)凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析。LAMP分析中SARS-CoV的檢測(cè)率和靈敏度與常規(guī)基于PCR的方法相似。Pyrc等成功地將LAMP用于瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)HCoV-NL63，在細(xì)胞培養(yǎng)物和臨床標(biāo)本中具有良好的靈敏度和特異性。值得注意的是，檢測(cè)極限是每個(gè)反應(yīng)1個(gè)RNA拷貝。可以檢測(cè)到焦磷酸鎂或熒光染料的沉淀。通過(guò)監(jiān)測(cè)焦磷酸鹽或熒光的濁度，可以使該方法實(shí)時(shí)進(jìn)行，從而有效地解決了終點(diǎn)檢測(cè)的局限性。

Shirato等人以這種方式開(kāi)發(fā)了一種有用的RT-LAMP測(cè)定法，用于診斷和監(jiān)測(cè)人類(lèi)MERS-CoV的流行病學(xué)。該技術(shù)能夠檢測(cè)到3.4份MERS-CoV RNA，并且具有高度特異性，與其他呼吸道病毒無(wú)交叉反應(yīng)。Thai等開(kāi)發(fā)了一種單步單管加速實(shí)時(shí)定量RT-LAMP測(cè)定法，該測(cè)定法通過(guò)在光度計(jì)中實(shí)時(shí)測(cè)量濁度進(jìn)行監(jiān)控，以早期和快速診斷SARS-CoV。在臨床樣品中，發(fā)現(xiàn)該檢測(cè)方法的靈敏度比常規(guī)RT-PCR高100倍，檢出限為0.01個(gè)噬菌斑形成單位（PFU）。

2.2 基于特定序列的LAMP方法

然而，如果這些方法依賴于非特異性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方案，例如熒光染料插入任何雙鏈DNA擴(kuò)增子中，或者由于聚合過(guò)程中焦磷酸鹽的釋放而導(dǎo)致溶液渾濁，則不能排除由引物二聚體或非引物反應(yīng)產(chǎn)生的意外信號(hào)的可能性。一種用于監(jiān)視LAMP和其他等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的序列特定且可靠的方法，可以輕松地將真實(shí)信號(hào)與非特異性噪聲區(qū)分開(kāi)來(lái)，解決此問(wèn)題。

Shirato等通過(guò)使用淬滅探針（QProbe）監(jiān)測(cè)信號(hào)改進(jìn)了RT-LAMP測(cè)定，在檢測(cè)MERS-CoV方面與標(biāo)準(zhǔn)實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定具有相同的性能。此外，黃等建立了一種將RT-LAMP和垂直流可視化條帶（RT-LAMP-VF）結(jié)合使用檢測(cè)MERS-CoV的核酸可視化技術(shù)。如圖1A 所示，等溫?cái)U(kuò)增中涉及的兩個(gè)環(huán)引物（LF和LB）分別用異硫氰酸熒光素（FITC）和生物素標(biāo)記。擴(kuò)增后，用生物素標(biāo)記的擴(kuò)增子可以結(jié)合與鏈霉親和素綴合的膠體金顆粒，形成復(fù)合物，隨后被包被在條帶文本行上的抗FITC抗體捕獲（圖1 B），從而呈現(xiàn)出肉眼可見(jiàn)的彩色線。在這種情況下，MERS-CoV RNA的檢出限為10拷貝/ L。

圖1. RT-LAMP-VF分析的示意圖。（A）用于RT-LAMP的擴(kuò)增反應(yīng)和（B）在可視化條上檢測(cè)。

埃靈頓小組的科學(xué)家做了很多工作，既可以提高LAMP檢測(cè)的特異性，又可以使讀數(shù)更簡(jiǎn)單、更可靠。他們用稱(chēng)為單步鏈置換（OSD）的介導(dǎo)鏈交換反應(yīng)代替了通常用于實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)的嵌入染料，并將其用于LAMP擴(kuò)增子的實(shí)時(shí)序列特異性驗(yàn)證。所得檢測(cè)結(jié)果可在30-50分鐘內(nèi)檢測(cè)出感染細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的0.02-0.2 PFU（5-50 PFU / mL）的MERS-CoV，并且不會(huì)與常見(jiàn)的人類(lèi)呼吸道病原體發(fā)生交叉反應(yīng)還開(kāi)發(fā)了其他鏈交換信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，以使LAMP反應(yīng)易于使用。如圖2所示，Du等通過(guò)將LAMP與熱穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化酶結(jié)合，可以直接將MERS冠狀病毒模板轉(zhuǎn)導(dǎo)為葡萄糖信號(hào)，通過(guò)商業(yè)血糖儀輕松讀取信號(hào)，可檢測(cè)20–100拷貝/ L。人絨毛膜促性腺激素（hCG）也被用作信號(hào)進(jìn)行分析。hCG與DNA寡核苷酸位點(diǎn)特異性結(jié)合，從而在基于LAMP的病毒測(cè)定中允許通過(guò)鏈交換將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到hCG的捕獲（信號(hào)關(guān)閉）和釋放（信號(hào)打開(kāi)）中。當(dāng)人血清和唾液中僅有20拷貝病毒模板時(shí)，通過(guò)該方法也能準(zhǔn)確檢測(cè)到。

圖2 使等溫?cái)U(kuò)增適應(yīng)血糖儀的方案。 

同時(shí)，LAMP在65 C左右顯示最佳性能，這限制了其應(yīng)用。蔡等開(kāi)發(fā)了一種LAMP版本，該版本使用了硫代磷酸酯化引物（PS-LAMP），能夠在生長(zhǎng)輔酶的末端更有效地形成和延伸發(fā)夾，從而在較低的溫度下工作。研究表明，在40 C下用PS-LAMP檢測(cè)擴(kuò)增子的靈敏度和選擇性與65 C下的常規(guī)LAMP反應(yīng)相當(dāng)。

2.3  基于滾環(huán)擴(kuò)增放大的方法

滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）在核酸檢測(cè)中已經(jīng)獲得了相當(dāng)大的關(guān)注。在等溫條件下，RCA能夠在90分鐘內(nèi)將每個(gè)圓的信號(hào)放大109倍。有學(xué)者在液相和固相中都建立了通過(guò)RCA檢測(cè)SARS-CoV的有效方法，并在少量臨床呼吸道標(biāo)本上提供了初步結(jié)果。RCA的主要優(yōu)點(diǎn)是，它可以在恒溫條件下用最少的試劑進(jìn)行操作，并且避免了假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生，而這在基于PCR的測(cè)定中經(jīng)常遇到。

3 基于微陣列的方法

微陣列法是一種快速且高通量的檢測(cè)方法。在這種方法中，冠狀病毒RNA將首先通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生用特定探針標(biāo)記的cDNA。然后將這些標(biāo)記的cDNA加載到每個(gè)孔中，并與固定在微陣列上的固相寡核苷酸雜交，然后進(jìn)行一系列洗滌步驟以去除游離DNA。最后，可以通過(guò)檢測(cè)特定探針來(lái)檢測(cè)冠狀病毒RNA。由于其快速、高通量的優(yōu)越性，微陣列分析已廣泛用于冠狀病毒的檢測(cè)。

Shi等根據(jù)TOR2的序列設(shè)計(jì)了一個(gè)60 mer的寡核苷酸微陣列，并將其成功地用于臨床樣品中SARS冠狀病毒的檢測(cè)。但是，考慮到SARS-CoV的快速突變，Guo等開(kāi)發(fā)了一種微陣列，可在樣本檢測(cè)中以100％的準(zhǔn)確度檢測(cè)SARS-CoV的尖峰（S）基因中的24個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）突變。Luna等設(shè)計(jì)了一種無(wú)熒光的低成本，低密度寡核苷酸陣列，用于檢測(cè)整個(gè)冠狀病毒屬，其靈敏度與各個(gè)實(shí)時(shí)RT-PCR的靈敏度相同，Hardick等（2002）評(píng)估了一種基于微陣列芯片的新型，便攜式和近POC診斷平臺(tái)，即移動(dòng)分析平臺(tái)（MAP），它在識(shí)別病毒和可接受的檢測(cè)限方面具有良好的性能。

4 新開(kāi)發(fā)的方法

相關(guān)酶的Cas13 RNA靶向CRISPR最近已適于核酸[快速和便攜式傳感。Zhang的研究小組證明，Cas13可以被編程為靶向并破壞多種哺乳動(dòng)物單鏈RNA病毒的基因組（圖3）。他們開(kāi)發(fā)了一個(gè)名為SHERLOCK（特定的高靈敏度酶報(bào)告分子解鎖）的平臺(tái)，該平臺(tái)將等溫預(yù)擴(kuò)增與Cas13結(jié)合使用，以檢測(cè)RNA或DNA的單分子。它可以檢測(cè)登革熱或Zika病毒單鏈RNA以及患者液體活檢樣品中的突變。網(wǎng)站（https://broad.io/sherlockprotocol）上報(bào)道了他們最近關(guān)于COVID-19的協(xié)議，題為“使用CRISPR診斷程序檢測(cè)COVID-19的協(xié)議”，該協(xié)議可能為有興趣進(jìn)一步研究的研究人員提供一些參考點(diǎn)該診斷系統(tǒng)突出了其作為核酸的可復(fù)用，便攜式，快速和定量檢測(cè)平臺(tái)的潛力。

圖3 使用Cas13檢測(cè)RNA病毒的方案。

總結(jié)與展望

當(dāng)前，COVID-19的診斷主要依賴于冠狀病毒RNA的檢測(cè)。選擇適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法非常重要。但是，上述每種方法都有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)和不可避免的缺點(diǎn)。PCR以高靈敏度和特異性廣泛用于病毒鑒定，但其分析需要各種專(zhuān)業(yè)設(shè)備和受過(guò)專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)的分析人員，而這只能由完善的實(shí)驗(yàn)室來(lái)完成。LAMP是一種超靈敏的核酸擴(kuò)增方法，通?？梢栽诖蠹s一個(gè)小時(shí)內(nèi)檢測(cè)少量的DNA或RNA模板，但是高溫的要求仍然限制了其適用性。至于微陣列，高成本不可避免地限制了它在冠狀病毒檢測(cè)中的進(jìn)一步應(yīng)用。因此，

迄今為止，科學(xué)家門(mén)已經(jīng)做出了很大的努力來(lái)改善冠狀病毒的檢測(cè)，并且已經(jīng)開(kāi)發(fā)了各種改進(jìn)的或新的方法。在實(shí)際應(yīng)用中，通常將幾種方法結(jié)合起來(lái)，以盡量避免使用單一方法的弊端。簡(jiǎn)而言之，隨著新技術(shù)和方法的飛速發(fā)展，我們相信未來(lái)將開(kāi)發(fā)出更加出色和高效的檢測(cè)方法，這將為科學(xué)家/臨床醫(yī)生提供更多選擇。同時(shí)，只有根據(jù)特定目的平衡各種檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)，才能獲得最經(jīng)濟(jì)，最優(yōu)化的選擇。

作者蔡圣：現(xiàn)任浙江大學(xué)藥學(xué)院副教授，碩士生導(dǎo)師。主要從事藥物分析新方法新技術(shù)研究，包括功能納米材料、核酸適配體技術(shù)在蛋白及藥物檢測(cè)中的應(yīng)用；核酸擴(kuò)增方法在藥物和藥物效應(yīng)分子檢測(cè)和成像中的應(yīng)用。

關(guān)于JPA：JPA于2011年創(chuàng)刊，是一本藥物分析研究領(lǐng)域的英文專(zhuān)業(yè)期刊，由教育部主管、西安交通大學(xué)主辦，與Elsevier合作出版，西安交通大學(xué)藥物分析研究所賀浪沖教授擔(dān)任主編。