Pikogreen dsDNA定量試劑盒(超敏)（兼容Qubit 3.0）產(chǎn)品描述

Pikogreen dsDNA 定量試劑盒（Pikogreen HighSensitivity dsDNA Quantitation Kit）不同于常規(guī)的基于吸光度的測量，這款試劑盒可以區(qū)分dsDNA、ssDNA或RNA，有選擇性地檢測dsDNA（見圖1）。與傳統(tǒng)DNA定量方法相比，該產(chǎn)品具有檢測范圍廣、高靈敏度、高特異性等優(yōu)點。試劑盒主要包含Pikogreen High Sensitivity dsDNA Quantitation Buffer, Enhancer solution以及pre-diluted dsDNA Standards三個組分，可以在200 uL體系內(nèi)定量0.2-100 ng的dsDNA（見圖2）。此外，試劑盒還可以將其他污染物的影響降低至zui低，可以耐受常規(guī)污染物例如蛋白質(zhì)，鹽，有機溶劑和洗滌劑等（見表1），該試劑盒不具有細胞膜通透性，沒有細胞毒性和誘發(fā)突變性，對人體安全無害。

Pikogreen dsDNA定量試劑盒(超敏)（兼容Qubit 3.0） 產(chǎn)品組分

組分

D1101L1127

D1101L1126

A: Pikogreen High Sensitivity dsDNA Quantitation Solution

50 mL

250 mL

B: Pikogreen High Sensitivity dsDNA Enhancer, 100

1 mL

5 mL

C: dsDNA Standards 0 , 0.5, 1, 2 ,4 ,6, 8 and 10 ng/uL dsDNA from calf thymus

每組 0.1 mL（8組）

每組 0.5mL（8組）

技術(shù)參數(shù)

Ex/Em 485/530nm （結(jié)合dsDNA）

運輸和保存方法

冰袋運輸，4℃避光保存，推薦條件下至少可以儲存6個月

Pikogreen dsDNA定量試劑盒(超敏)（兼容Qubit 3.0）使用方法

1、為了得到zui佳結(jié)果，請使用精確校準的移液器和去RNA酶的槍頭、試管以及檢測板。建議檢測時每個DNA標樣和未知樣品都設(shè)定3個復(fù)孔。如果檢測時不只一塊96孔板，建議每塊96孔板都設(shè)定一條標準曲線，盡量減少檢測板之間的誤差。

2、使用前，將產(chǎn)品從儲存條件下取出恢復(fù)至室溫。如果100XEnchancer儲存液出現(xiàn)沉淀，可37℃水浴溶解。每個組分應(yīng)充分震蕩或渦旋混勻、離心，以免造成不必要的試劑損耗

3、每個待測樣品對應(yīng)200uL的Pikogreen工作液。對于一個96孔板，吸取200uL 100X Enchancer，加入到20mL Quantitation Solution 中，渦旋混勻，配置成Pikogreen工作液，為得到zui佳結(jié)果，工作液應(yīng)在一小時內(nèi)使用完畢。如果將工作液重新儲存并在24小時內(nèi)使用，結(jié)果的準確性會有輕微損失。儲存過程中，增強液可能會出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象，可以通過渦旋震蕩使其重懸。

4、對于每個樣品，吸取200 uL的工作液至黑色的96孔板微孔中。為確保結(jié)果精確可靠，建議每個測試樣品和DNA標樣分別做平行的3個復(fù)孔，此過程也可以使用有精確量程的移液排槍進行。黑色的檢測板可以減少各測試樣品間的熒光干擾。

5、在96孔板微孔中，每孔加入10 uL的dsDNA標樣或未知樣品，并用移液器輕輕混勻。

6、將微孔板室溫避光孵育5-10分鐘，為得到zui佳結(jié)果，孵育結(jié)束后，應(yīng)立即讀取檢測板。也可以在6小時內(nèi)讀取數(shù)據(jù)，但結(jié)果的精確性會有輕微損失。

7、使用激發(fā)波長和發(fā)射波長在485 nm和530 nm處的酶標儀測量熒光值。

8、制作一條標準曲線，計算檢測樣品的DNA濃度（見圖2）。

注：圖2標準曲線僅供參考，您可以根據(jù)實際測得的數(shù)據(jù)自制標準曲線，從而求算樣品的濃度。

圖1：使用Pikogreen High Sensitivity dsDNA 定量試劑盒檢測不同類型核酸得到的相對熒光強度

圖2：使用Pikogreen Hig Sensitivity dsDNA 定量試劑盒制作的calf thymus DNA標準曲線（Ex/Em 485/530），左上角插圖顯示了低濃度DNA樣本測定的曲線圖。

Pikogreen dsDNA定量試劑盒(超敏)（兼容Qubit 3.0）注意事項

1、對于要檢測的植物或動物來源的DNA樣本，小牛胸腺DNA（Calf thymus DNA ）常常作為制作DNA標樣的參照物。因為Calf thymus DNA具有雙鏈結(jié)構(gòu)、高度聚合，堿基分配均勻（AT含量58%，GC42%）。如果檢測樣品的熒光值超過了標準曲線，那么需要將樣品做進一步稀釋處理。為了保持結(jié)果的一致性，務(wù)必使每孔上樣量均等，且不含有其他高濃度的污染物。

2、Pikogreen High Sensitivity dsDNA 定量試劑盒可以測量范圍在0.2-100 ng的dsDNA。對于一些不需要線性檢測的樣品，試劑盒檢測范圍可以擴展至200 ng。如需檢測更低含量的樣品，您可以將DNA標樣用1 TE緩沖液作進一步的稀釋，濃度可以稀釋到0.02 ng/uL，然后按照常規(guī)程序每孔10 uL上樣。

3、對于不同種類的檢測儀器，您可以優(yōu)化儀器設(shè)置，以獲取zui佳線性度。一些可能會影響zui終線性度和相對熒光強度的因素有（1）激發(fā)和發(fā)射波長與帶寬；（2）截止型濾波器；（3）靈敏度設(shè)置；（4）移液的準確性；（5）微孔板制造商。

4、附表1. 詳細列出了幾種常見的DNA污染物，如鹽、溶劑、洗滌劑和蛋白質(zhì)等。

附表1. 常見的DNA污染物對 Pikogreen High Sensitivity dsDNA 定量試劑盒的影響

復(fù)合物

初始濃度

終濃度（200uL）

結(jié)果

醋酸銨

100 mM

5 mM

Pass

醋酸鈉

600 mM

30 mM

Pass

氯化鈉

200 mM

10 mM

Pass

氯化鎂

25 mM

1.25 mM

Pass

苯酚

2 %

0.1 %

Pass

乙醇

10 %

0.5 %

Pass

chlorofrom

2 %

0.1 %

Pass

十二烷基硫酸鈉（SDS）

0.2 %

0.01 %

Pass

Triton X-100

0.2 %

0.01 %

Pass

牛血清白蛋白(BSA)

200 mg/mL

10 mg/mL

Pass*

dNTPs**

2 mM

100 uM

Pass

聚乙二醇

40 %

2 %

Pass

瓊脂糖

2 %

0.1 %

Pass

注：三份dsDNA平行樣品的標準曲線，分別在上述含有指定濃度污染物的條件下（初始濃度進行檢測， Pass 指與沒有污染物的體系相比較，實驗結(jié)果變化范圍 20%。所有樣品用Molecular DevicesGemini XS酶標儀在485 nm處激發(fā)，在530 nm處測熒光強度。 Pass * 指由此條件測得的標準曲線有少許變動。 dNTPs** 指dATP, dCTP, dGTP, dTTP的混合物。