【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：人 ALDH2 基因檢測試劑盒(熒光 PCR 法)

英文名稱：Human ALDH2 Gene Detection Kit

【包裝規(guī)格】 48 人份/盒

 

【檢驗(yàn)原理】

 

本試劑盒采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）結(jié)合 Taqman-MGB 探針技術(shù)，針對人類 ALDH2 基因 G1510A 多態(tài)

 

性位點(diǎn)，設(shè)計(jì) 1 套特異性引物和探針組合，一個反應(yīng)體系中通過兩種不同通道檢測一個位點(diǎn)的基因多態(tài)性。利

 

用儀器對 PCR 過程中相應(yīng)通道的信號強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測和輸出，實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。

 

【主要組成成分】

 

序號

試劑名稱

主要組成成分

裝量規(guī)格

 

 

 

 

1

ALDH2 反應(yīng)液

PCR 緩沖液、dNTPs、Taq DNA 聚合酶、引物、探針

1 管（960 l）

 

 

 

 

2

陽性對照

ALDH2 基因和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)?；旌弦?/p>

1 管（100 l）

 

 

 

 

3

陰性對照

1 TE  緩沖液

1 管（100 l）

 

 

 

 

【儲存條件及有效期】

 

試劑盒于-20℃ 5℃避光貯存，ALDH2 反應(yīng)液反復(fù)凍融不宜超過 5 次，試劑開封后請于 2 個月內(nèi)使用。

 

采用加冰或泡沫盒加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸，運(yùn)輸時間不宜超過 7 天；

 

試劑盒在正確儲存條件下有效期為 12 個月。生產(chǎn)日期和使用期限見產(chǎn)品標(biāo)簽。

 

【適用儀器】

 

ABI7500 熒光定量 PCR 儀、BioRad CFX96 熒光定量 PCR 儀。

 

 

1

 

【樣本要求】

 

本試劑盒適用于從抗凝全血（不可用肝素）中提取人類基因組 DNA 進(jìn)行檢測，-20℃保存，避免反復(fù)凍融。

 

樣本采集后應(yīng)及時進(jìn)行處理及檢測，可在 2℃～8℃可保存 7 天，置于 -20℃條件下可保存 1 年，避免反復(fù)凍融。

 

樣本運(yùn)輸采用

加冰或泡沫盒加冰密封運(yùn)輸。

 

【檢驗(yàn)方法】

 

PCR 前處理

 

1.1 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備室）：

 

1） 從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫，各組分充分融解，渦旋混勻，快速離心 10 秒。

 

2） 核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)（N），按照 20 l/孔的分裝量將 ALDH2 反應(yīng)液分裝到 N 個 PCR 反應(yīng)管內(nèi)。

 

PCR 反應(yīng)管通過傳遞窗轉(zhuǎn)移至樣本處理室，剩余試劑放回-20℃ 5℃冰箱避光保存。

 

N=  樣本數(shù)+陰性對照（1T）+陽性對照（1T）

 

1.2 樣本準(zhǔn)備（樣本處理室）：

 

1） 樣本 DNA 提?。簠⒖妓徺I的商用基因組 DNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行操作。

 

推薦使用天根生化科技（北京）有限公司血液基因組提取試劑盒（TIANamp Blood DNA Kit，DP318），用

 

于血液基因組 DNA 的提取。

 

2）加樣：將待測樣本的基因組 DNA、陰性對照、陽性對照分別加入已裝有 ALDH2 反應(yīng)液的 PCR 反應(yīng)管，加入量為 5 l/孔。蓋好 PCR 反應(yīng)管蓋，記錄樣本加樣情況。瞬時低速離心，將 PCR 反應(yīng)管轉(zhuǎn)移到核酸擴(kuò)

 

增區(qū)進(jìn)行上機(jī)檢測。若 PCR 反應(yīng)管內(nèi)加入模板后遇臨時情況不能立即上機(jī)，建議將加好模板的 PCR 反應(yīng)

 

管置于 2~8℃暫時保存，并在 24 小時內(nèi)盡快上機(jī)檢測。

 

PCR 擴(kuò)增（PCR 擴(kuò)增室）：

 

將準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管放置在儀器樣本槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序。按表1設(shè)置儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)：

 

表1：儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)

 

 

階段

溫度

時間

循環(huán)數(shù)

 

 

 

 

 

PCR 反應(yīng)條件

預(yù)變性

95℃

5 min

1 cycle

 

 

 

 

 

變性

95℃

10 s

40 cycles

 

 

 

 

 

退火、延伸及檢測熒光

60℃

45 s

 

 

 

 

 

 

 

檢測通道

ALDH2*G VIC 通道；ALDH2*A FAM 通道；內(nèi)標(biāo)基因 ROX 通道

 

 

 

 

 

*注：passive reference  和 quencher處均選擇 none 。

 

基線和閾值設(shè)定

 

反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增曲線，設(shè)定合適的基線（baseline）和熒光閾值（Threshold）。baseline 設(shè)為 3-15 （根據(jù)實(shí)際情況，baseline Cycler 可在一定范圍內(nèi)變化），熒光閾值一般設(shè)定在擴(kuò)增曲線指數(shù)增長期的拐點(diǎn)，得到不同通道的 Ct 值。

質(zhì)量控制

 

1）陰性對照：FAM、VIC、ROX 均無擴(kuò)增曲線或擴(kuò)增曲線為輕微斜線，且 Ct 顯示為 Undet。

 

2）陽性對照：FAM、VIC、ROX 三個通道均有典型的 S 型擴(kuò)增曲線且 Ct 值 30。

 

檢測結(jié)果的判定

 

 

2

 

在陰性對照和陽性對照均正常的情況下，結(jié)果判斷如下：

 

表2：結(jié)果判定

 

反應(yīng)液

基因型

FAM通道

VIC通道

ROX通道

 

 

 

 

 

 

GG

Ct 36

Ct 36

Ct 38

 

 

 

 

純合野生

 

或無Ct值

 

 

 

 

 

 

ALDH2反應(yīng)液

AG

Ct 36

Ct 36

Ct 38

 

 

雜合突變

 

 

 

 

 

 

 

 

 

AA

Ct 36

Ct 36

Ct 38

 

 

 

 

純合突變

或無Ct值

 

 

 

 

 

 

 

 

待檢樣本內(nèi)標(biāo) ROX 通道 Ct 值如果 38，則需對核酸提取物進(jìn)行重復(fù)檢測，如仍 38，則需重新對樣本進(jìn)

 

行提取或者重新采樣提取后進(jìn)行檢測。

 

待檢樣本內(nèi)標(biāo) ROX 通道 Ct 值 38，但 FAM 和 VIC 通道 Ct 值均 36，也需對核酸提取物進(jìn)行重復(fù)檢測，

 

必要時需要重新提取或重新采樣。

 

【陽性判斷值】

 

根據(jù)臨床樣本檢測結(jié)果的數(shù)據(jù)，基于 ROC 曲線分析方法統(tǒng)計(jì)確定陽性判斷值，并通過大量樣本的檢測結(jié)

 

果對該陽性判斷值進(jìn)行確認(rèn)。

 

【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

 

本試劑盒的檢測結(jié)果僅供臨床參考，對患者的臨床診治應(yīng)結(jié)合其癥狀/體征、病史、其他實(shí)驗(yàn)室檢查及及治

 

療反應(yīng)等情況綜合考慮。當(dāng)檢測過程中不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)及處理導(dǎo)致的檢測樣本中被檢核酸濃度含量低

 

于zui低檢測限，會導(dǎo)致結(jié)果判讀的錯誤。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境污染，試劑污染，樣品交叉污染也會導(dǎo)致結(jié)果判讀錯誤；

 

試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降，會出現(xiàn)與實(shí)際不符的結(jié)果。

 

【檢驗(yàn)方法的局限性】

 

本試劑盒的檢測結(jié)果僅供臨床參考，對患者的臨床診治應(yīng)結(jié)合其癥狀/體征、病史、其他實(shí)驗(yàn)室檢查及治療反應(yīng)等情況綜合考慮。

 

模板 DNA 的質(zhì)量可能受樣本來源、采集過程、運(yùn)輸條件、樣本處理等因素影響，同時也受 DNA 提取方法、PCR 儀類型、操作環(huán)境以及當(dāng)前分子生物學(xué)技術(shù)的局限性等的限制，可能導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性和假陰性的檢測結(jié)果。

 

有關(guān)假陰性結(jié)果的可能性分析：

 

不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)及處理、樣本濃度過低均有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。待測靶序列的變異或其它原因?qū)е碌男蛄懈淖兛赡軙?dǎo)致假陰性結(jié)果。

 

低于產(chǎn)品zui低檢測限的樣本無法檢出。

 

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

 

本試劑盒zui低檢出限：1 102 copies/ l。

 

分析特異性：利用本試劑盒檢測與 ALDH2 基因檢測片段相似度高的人基因序列合成的陽性質(zhì)粒，以及金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的基因組 DNA 均不會發(fā)生交叉。

 

準(zhǔn)確性：采用企業(yè)陰陽性參考品對試劑盒進(jìn)行檢測，其陰陽性符合率 100%。

 

 

3

 

精密度：本試劑盒的批內(nèi)和批間的精密度參考品 Ct 值的變異系數(shù)均  5.0%。

 

臨床試驗(yàn)：

 

【注意事項(xiàng)】

 

試劑盒使用前應(yīng)仔細(xì)閱讀說明書。

 

本試劑盒為體外檢測試劑。操作人員應(yīng)經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)并具有一定經(jīng)驗(yàn)。

 

整個實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)分三個區(qū)域進(jìn)行（試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)、PCR 擴(kuò)增區(qū)），請嚴(yán)格分區(qū)操作；各區(qū)專用的儀器、設(shè)備、耗材和工作服均為專用，不得交叉使用；避免污染，實(shí)驗(yàn)后請立即清潔工作臺。本產(chǎn)品使用前應(yīng)在室溫充分融化，混勻并瞬時離心。

 

每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)置陰性對照和陽性對照。不同批號的試劑請勿混用，于有效期內(nèi)使用試劑盒。

 

凍存的 DNA 樣本，加樣前應(yīng)在室溫充分融化、混勻并瞬時離心后使用。

 

反應(yīng)液分裝時盡量避免產(chǎn)生氣泡，放入擴(kuò)增儀前應(yīng)檢查各 PCR 反應(yīng)管是否蓋緊，避免對儀器及環(huán)境的污染。

 

本試劑盒所涉及的待測樣本應(yīng)視為具有傳染性物質(zhì)，操作和處理均需符合衛(wèi)生部《微生物和生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則》和《醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例》相關(guān)要求。