脂肪酸 氧化速率比色法檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

 

主要用途

 

脂肪酸 氧化速率（ oxidation rate）比色法檢測試劑是一種旨在通過棕櫚酰肉堿氧化依賴性鐵氰化物還原，即單位時間還原產(chǎn)物的峰值降低，即采用比色法來測定線粒體裂解樣品中脂肪酸 氧化速率的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞、組織中線粒體裂解懸液樣品（動物、人體等）脂肪酸 氧化速率的檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

脂肪酸 氧化過程（ -oxidation）在動物組織的線粒體發(fā)生的脂肪酸代謝通路，可概括為活化、轉(zhuǎn)移、 氧化及zui后經(jīng)三羧酸循環(huán)被徹底氧化生成CO2和H2O，并釋放能量等四個階段，是體內(nèi)，尤其是組織器官，例如肝臟、心臟和骨骼肌等能量內(nèi)平衡的關(guān)鍵代謝通路。食物中甘油三酯提供體內(nèi)三分之一的能量供給，骨骼肌和心臟消耗80%的總能量。脂肪酸代謝異常，將導致脂質(zhì)聚集在非脂肪組織內(nèi)，產(chǎn)生慢性病的病理基礎(chǔ)，例如糖尿病、心衰、肥胖癥等。其中 氧化，包括脫氫、水合、二次脫氫和硫解，是將活化的各種長度脂酰輔酶酯（acyl CoA esters）不斷縮短為乙酰輔酶A（acetyl CoA）單位，zui后經(jīng)過三羧酸循環(huán)和呼吸鏈氧化成CO2和水。脂?；o酶A脫氫酶（acyl CoA dehydrogenase；AD；EC.1.3.99.3）是脂肪酸代謝進入 -氧化后工作的重要酶之一。通過底物棕櫚酰肉堿（palmitoyl carnitine）的氧化產(chǎn)生的電子，由鐵氰化物（ferricyanide）捕獲而還原，其還原速率的檢測，來評價 氧化的速率，即吸光值（420nm波長）的下降與時間的對應(yīng)關(guān)系。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

緩沖液（Reagent A）  20毫升

反應(yīng)液（Reagent B）  2毫升

底物液A（Reagent C）  1毫升

底物液B（Reagent D）  1毫升

陰性液（Reagent E）    1毫升

產(chǎn)品說明書    1份

 

保存方式

 

保存反應(yīng)液（Reagent B）、底物液A（Reagent C）和底物液B（Reagent D）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；底物液A（Reagent C）和底物液B（Reagent D）避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于反應(yīng)操作的容器

比色皿：用于比色的容器

分光光度儀：用于比色分析

 

實驗步驟

 

測定準備

 

準備好待測樣品（例如純化線粒體），至于冰槽里備用開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長420nm和470nm，間隔1分鐘，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；底物液A（Reagent C）和底物液B（Reagent D）避免光照緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度

 

背景對照測定

 

移取750微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿加入100微升反應(yīng)液（Reagent B）加入50微升底物液A（Reagent C）加入50微升底物液B（Reagent D）上下傾倒數(shù)次，混勻在25℃溫度下孵育3分鐘加入50微升陰性液（Reagent E）上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照【（OD420 OD470）0分鐘－（OD420 OD470）5分鐘】

 

樣品測定

 

移取750微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿加入100微升反應(yīng)液（Reagent B）加入50微升底物液A（Reagent C）加入50微升底物液B（Reagent D）上下傾倒數(shù)次，混勻在25℃溫度下孵育3分鐘加入50微升待測樣品（500微克線粒體蛋白）（注意：樣品須清澈）上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)【（OD420 OD470）0分鐘－（OD420 OD470）5分鐘】 

 

四、計算氧化速率

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)] [0.5（樣品質(zhì)量；毫克）X 105（毫摩爾吸光系數(shù)）X 5（反應(yīng)時間；分鐘）]＝微摩爾鐵氰化物還原/分鐘/毫克

 

注意事項

 

本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對照操作時，須戴手套系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次樣品須澄清，至關(guān)重要 加樣后3秒內(nèi)比色測定測定值由高到低變化；測定可持續(xù)5分鐘比色測定后，比色皿須清洗徹底樣本測定0分鐘讀數(shù)高于5分鐘讀數(shù)表明具有氧化功能建議待測樣本線粒體蛋白濃度為500微克/50微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1） 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度本公司提供系列脂肪酸代謝檢測試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標準

 

本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感