實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（real-time PCR）技術(shù)和普通 PCR 相比，準(zhǔn)確性和靈敏度高，速度快，效率高，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物等各個(gè)領(lǐng)域，是進(jìn)行分子生物學(xué)研究必不可少的技術(shù)工具。在科研方面可定量分析各種基因的的表達(dá)分析，基因突變和多態(tài)性分析，單核苷酸多態(tài) SNP 測(cè)定及易位基因的檢測(cè)；在醫(yī)療方面可用于免疫組化分析臨床疾病早期診斷，病原體檢測(cè)，耐藥性分析，腫瘤微小殘留病變研究，細(xì)胞因子的表達(dá)分析，病毒感染的定量檢測(cè)等。

在整個(gè)熒光定量 PCR 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，引物的設(shè)計(jì)是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素，很大程度決定了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性，一般 real-time PCR 引物的設(shè)計(jì)應(yīng)遵循如下原則：

1. 引物應(yīng)在核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。

2. 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度在 80-150bp。zui長(zhǎng)不要超過(guò) 300bp。

3. 產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)（自由能小于 58.61KJ/mol）。

4. 引物長(zhǎng)度：一般在 17-25 堿基之間，上下游引物不宜相差太大。引物長(zhǎng)度是決定退火溫度（Tm 值）zui重要的因素。一般來(lái)講，每增加一個(gè)核苷酸可使引物特異性提高 4 倍，但是由于熵的原因，引物越長(zhǎng)，它退火結(jié)合到靶 DNA 上形成供 DNA 聚合酶結(jié)合的穩(wěn)定雙鏈模板的速率越小。

5. 引物自身不能有連續(xù) 4 個(gè)堿基的互補(bǔ)，避免形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。

6. 引物之間不能有連續(xù) 4 個(gè)堿基的互補(bǔ)，避免形成引物二聚體。

7. 引物 G+C 含量在 40%～60% 之間，45-55％ zui好。引物中堿基要隨機(jī)分布，盡量均勻，若是引物存在嚴(yán)重的 GC 傾向或 AT 傾向則可以在引物 5』端加適量的 A、T 或 G、C 尾巴來(lái)平衡一下。

8. 引物 Tm 值在 58-62 度之間，上下游引物 Tm 值不宜相差太大，zui好不要超過(guò) 5 度。如果引物堿基數(shù)較少，可以適當(dāng)提高退火溫度，提高 PCR 的特異性；如果堿基數(shù)較多，那么可以適當(dāng)減低退火溫度，使 DNA 雙鏈結(jié)合。

9. 引物 5 端可以修飾；引物 5 端一般不會(huì)影響擴(kuò)增的特異性，可進(jìn)行修飾，如加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列等。

10. 引物 3 端不可修飾，引物 3』端是延伸開(kāi)始的地方，決定擴(kuò)增的特異性。3』端應(yīng)避開(kāi)連續(xù)的 T/C,A/G（2-3 個(gè)）；也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)。

11. 引物 3 端要避開(kāi)密碼子的第 3 位。因?yàn)槊艽a子的兼并性，因密碼子的第 3 位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率。

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