銘修（上海）生物科技有限公司

主營產(chǎn)品： 各種標(biāo)準(zhǔn)品、試劑、染色液、培養(yǎng)基、抗體、試劑盒、透析袋 細(xì)胞、實驗室常規(guī)儀器

【詳細(xì)說明】

 人體hTERT基因甲基化檢測試劑盒產(chǎn)品說明書(中文版)

 

主要用途

 人體hTERT基因甲基化檢測試劑是一種旨在通過化學(xué)方法使基因組中的所有胞嘧啶（CYTOSINE）轉(zhuǎn)變成尿嘧啶（URACIL），而保留了所有甲基化的胞嘧啶，經(jīng)過甲基化特異性PCR擴(kuò)增，探測到人體人體端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因hTERT啟動子CpG島甲基化信息的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。可以被用于人體人體端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因hTERT相關(guān)的表觀遺傳學(xué)研究。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，操作簡便，轉(zhuǎn)化保證。

 

技術(shù)背景

 

在基因的啟動子區(qū)域（promotor region）通常存在一些富含重復(fù)雙核苷酸 CG 的區(qū)域，稱為 CpG島 （CpG island）。在人類基因組內(nèi)，存在有近3萬個CpG島。這些CpG島不僅是基因的一種標(biāo)志，而且還參與基因表達(dá)的調(diào)控和影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，更是DNA甲基化的*位置。CpG島甲基化形態(tài)的掃描分析是基因表達(dá)和表觀基因組學(xué)的主要課題。人體端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human omerase reverse transcriptase；hTERT），又稱hTRT、hTCS1 和hEST2，是端粒酶的核心結(jié)構(gòu)，即催化亞體（catalytic subunit）。hTERT的功能性表達(dá)是端粒酶獲得活性的前提。hTERT可以激活端粒酶，使細(xì)胞獲得永生化。hTERT是端粒酶活性的限速決定成分，其mRNA表達(dá)水平與端粒酶活性之間具有密切的相關(guān)性。hTERT是一單拷貝基因，定位于5q15.33，屬于逆轉(zhuǎn)錄酶家族，具有進(jìn)化上的保守性，序列總長約35kb，由16個外顯子和15個內(nèi)含子組成。端粒酶特異性T-motif和7個同源保守序列的RT-motif分別位于不同的外顯子上。hTERTmRNA 還有7種不同的剪切轉(zhuǎn)錄本，分為缺失型與插入型兩類。一旦突變或甲基化，會造成細(xì)胞繁殖調(diào)控機(jī)制缺失，而致腫瘤或細(xì)胞衰老等。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 緩沖液（Reagent A）  2 X 1.5 毫升 變性液（Reagent B） 250微升 處理液（Reagent C）  1毫升 轉(zhuǎn)化液（Reagent D）  12毫升 封隔液（Reagent E）  3毫升 凈化液（Reagent F）  20毫升 萃取液（Reagent G）    40毫升 濃縮液（Reagent H）  2毫升 助沉液（Reagent I）  20微升 沉淀液（Reagent J）  10毫升 清理液（Reagent K）    20毫升 保存液（Reagent L）  1毫升 擴(kuò)增液（Reagent M） 900微升 補(bǔ)充液（Reagent N）  1毫升 U引物F（Reagent O）  20微升 U引物R（Reagent P）  20微升 M引物F（Reagent Q）  20微升 M引物R（Reagent R）  20微升 針筒離心柱  20套

產(chǎn)品說明書  1份

 

保存方式

 

保存 MB處理液（Reagent C）、 MB轉(zhuǎn)化液（Reagent D）、 MB助沉液（Reagent I）、 MB擴(kuò)增液（Reagent M）、 MB補(bǔ)充液（Reagent N）、 MB U引物F（Reagent O）、 MB U引物R（Reagent P）、 MB M引物F（Reagent Q）和 MB M引物R（Reagent R）在－20℃冰箱里； MB凈化液（Reagent F）和 MB針筒離心柱保存在室溫下；其余的保存在4℃冰箱里； MB處理液（Reagent C）和 MB轉(zhuǎn)化液（Reagent D）避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

2.0毫升離心管：用于樣品操作的容器

恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)物

微型臺式離心機(jī)：用于沉淀樣品或去除雜質(zhì)

渦旋震蕩儀：用于混勻反應(yīng)物

真空泵：用于去除樣品中的液體成分

針筒擠壓塞：用于去除樣品中的液體成分

PCR儀：用于樣品擴(kuò)增

PCR管或平板：用于PCR反應(yīng)的容器

測序試劑盒：用于測序前的產(chǎn)物處理

 

實驗步驟

 

實驗開始前，將 MB處理液（Reagent C）和 MB轉(zhuǎn)化液（Reagent D）從－20℃冰箱中取出，置入室溫下。同時將其中一管 MB緩沖液（Reagent A）置入65℃恒溫水槽中預(yù)熱備用。然后進(jìn)行下列操作：

 

轉(zhuǎn)化實驗

 

準(zhǔn)備1個2.0毫升離心管加入2微克DNA樣品加入適量的 MB緩沖液（Reagent A）到50微升反應(yīng)體系（注意：不要使用65℃預(yù)熱的 MB緩沖液（Reagent A））加入5.5微升 MB變性液（Reagent B），混勻放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育12分鐘加入30微升 MB處理液（Reagent C）（注意：可見溶液呈現(xiàn)黃色）在渦旋震蕩儀上小心震蕩30秒，充分混勻加入520微升 MB轉(zhuǎn)化液（Reagent D），上下傾倒混勻加入100微升 MB封隔液（Reagent E）放進(jìn)55℃恒溫水槽孵育16小時小心抽去100微升 MB封隔液（Reagent E）加入1毫升充分搖勻的 MB凈化液（Reagent F），上下傾倒混勻（注意： MB凈化液（Reagent F）出現(xiàn)沉淀，37℃溫育后使用）移入到針筒離心柱連接到真空泵，將柱內(nèi)液體抽去（或使用用戶自備的針筒擠壓塞擠去柱內(nèi)液體）加入1毫升 MB萃取液（Reagent G）運(yùn)用真空泵，將 MB萃取液（Reagent G）抽去（或使用用戶自備的針筒擠壓塞擠去柱內(nèi)液體）重復(fù)實驗步驟15至16一次去掉針筒，將離心柱放在1.5毫升離心管放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心20秒，速度為16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）去掉殘余萃取液，更換新的1.5毫升離心管加入50微升65℃預(yù)熱的 MB緩沖液（Reagent A）到離心柱室溫下靜置1分鐘放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心20秒，速度為16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）去掉離心柱加入5.5微升 MB變性液（Reagent B）到離心管，混勻放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育12分鐘加入82微升 MB濃縮液（Reagent H）加入1微升 MB助沉液（Reagent I）加入400微升 MB沉淀液（Reagent J）在渦旋震蕩儀上震蕩30秒放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）小心抽掉上清液加入1毫升 MB清理液（Reagent K）放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）小心抽掉上清液空氣中晾干沉淀顆粒群加入20微升 MB保存液（Reagent L）放進(jìn)－20℃冰箱長期保存

 

二、甲基化特異性PCR

 

將 MB擴(kuò)增液（Reagent M）、 MB補(bǔ)充液（Reagent N）、 MB U引物F（Reagent O）、 MB U引物R（Reagent P）、 MB M引物F（Reagent Q）和 MB M引物R（Reagent R）從－20℃冰箱里取出置入冰槽里直至融化針對一個樣本，準(zhǔn)備2個PCR管，分別標(biāo)記為U和M管分別移出15微升 MB擴(kuò)增液（Reagent M）到PCR管里分別加入1微升上述轉(zhuǎn)化實驗中獲得的DNA樣品（總量100納克）分別加入1微升 MB U引物F（Reagent O）和 MB U引物R（Reagent P）到U管中分別加入1微升 MB M引物F（Reagent Q）和 MB M引物R（Reagent R）到M管中再分別加入7微升 MB補(bǔ)充液（Reagent N）（反應(yīng)總量為25微升）即刻放進(jìn)微型臺式離心機(jī)瞬時離心5秒，速度為500g（或2000RPM；例如eppendorf 5415）加入50微升PCR級礦物油（注意：參見注意事項9）即刻進(jìn)行熱啟動PCR反應(yīng)：

 

溫度（℃）

時間

循環(huán)

95

2分鐘

1

95

60

72

30秒

90秒

30秒

 

35

72

5分鐘

1

 

反應(yīng)完畢后，移取5微升進(jìn)行1.8%瓊脂糖凝膠電泳陽性條帶：轉(zhuǎn)化后非甲基型（U）――125 bp；轉(zhuǎn)化后甲基型（M）――115 bp

 

注意事項

 

本產(chǎn)品為20次操作操作時，須戴手套建議使用帶濾芯的槍頭，避免污染一個特定基因的甲基化特異性PCR通常包括：轉(zhuǎn)化后甲基型（M）、轉(zhuǎn)化后非甲基型（U）甲基化特異性PCR的引物設(shè)計原則：引物以SENSE的DNA鏈為模板；引物含有足夠多的C（后面不和G相連）；引物含有1－3個CpG位點(diǎn)；CpG位點(diǎn)須在3端；PCR片段長度在80－250堿基 U引物F（Reagent O）、 MB U引物R（Reagent P）、 MB M引物F（Reagent Q）和 MB M引物R（Reagent R）的信息如下：

 

引物名稱

序列

Tm（℃）

GeneID

片段

 MB M引物F（Reagent Q）

5- GGTTTCGTTTTTTTTTTGCGGC -3

60

AF098956

115

 MB M引物R（Reagent R）

5- GACTCGACAACGAAAAACGCG -3

60

AF098956

115

 MB U引物F（Reagent O）

5- TTGTGGTTTTGTTTTTTTTTTGTGGT -3

60

AF098956

125

 MB U引物R（Reagent P）

5- ACACACAACTCAACAACAAAAAAC ACA -3

60

AF098956

125

 

通過瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢測PCR擴(kuò)增后的結(jié)果。假如DNA樣品在修飾前是未甲基化的，那么僅僅 U Primers將產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物；相反，已甲基化的DNA樣品僅僅用 M Primer能被擴(kuò)增

 

組織樣品或雜合子樣品常常出現(xiàn) U 和 M 同時呈現(xiàn)陽性；建議使用 MB基因甲基化程度定量分析試劑盒（ MB20103）予以分析根據(jù)用戶PCR儀的性能，決定是否加入礦物油（Mineral Oil）必要時，可以調(diào)整Tm溫度 在－20℃冰箱里儲存的產(chǎn)品避免反復(fù)凍融轉(zhuǎn)化后的DNA保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融本公司同時提供系列基因甲基化分析試劑產(chǎn)品本公司提供系列甲基化分析試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定本產(chǎn)品經(jīng)鑒定轉(zhuǎn)化保證本產(chǎn)品經(jīng)鑒定無核酶污染本產(chǎn)品經(jīng)鑒定反應(yīng)產(chǎn)量高 上一篇：活體細(xì)胞溶酶體膜通透性（LMP）/ 下一篇：細(xì)胞對氧磷酶1（PON1）芳香酯酶返回列表
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