貨號：YJ2218  規(guī)格：50管/24樣

Na+ K+-ATP 酶活性測定說明書

可見分光光度法

正式測定前務(wù)必取 2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

Na+ K+- ATP 酶廣泛分布于植物、動物、微生物和細(xì)胞中，可催化ATP水解生成 ADP和無機(jī)磷。

測定原理：

Na+ K+-ATP 酶分解ATP生成ADP及無機(jī)磷，通過測定無機(jī)磷的量來確定 ATP 酶活性。

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸

餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 50mL 1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 10mL 1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 5mL 1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體 5ml 1 瓶，4℃保存。

試劑四：粉劑 3支，-20℃保存。用時每支加1mL蒸餾水，現(xiàn)用現(xiàn)配。用不完的試劑-20℃

可保存一周。

試劑五：液體 5mL 1 瓶，4℃保存。

試劑六：粉劑 1 瓶，4℃保存。用時加入 3mL 蒸餾水， 4℃保存。

試劑七：粉劑 1 瓶, 4℃保存。用時加入 25mL 蒸餾水，溶解后 4℃保存一周。

試劑八：粉劑 1 瓶, 4℃保存。用時加入 25mL 蒸餾水，溶解后 4℃保存一周。

試劑九：液體 25mL 1 瓶，室溫保存。

試劑十：10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 10mL 1 瓶，4℃保存。

0.5 mol/mL標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制：將貯備液20倍稀釋，即取0.1mL試劑十加1.9mL蒸餾水

 充分混勻。

定磷劑的配制：按 H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

樣品酶液的制備：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

操作步驟

1、分光光度計預(yù)熱 30min以上，調(diào)節(jié)波長至660nm，蒸餾水調(diào)零。

2、酶促反應(yīng)（在 EP 管中加入下列試劑）

對照管  

測定管

試劑一（ L）  

130

90

試劑二（ L）  

40

40

試劑三（ L）  

40

40

試劑四（ L）  

40

40

試劑五（ L）  

40

樣本 （ L）  

200

混勻，37℃（哺乳動物）或 25℃（其他物種）準(zhǔn)確水浴 10min

試劑六（ L）  

50

50

樣本 （ L）

200

混勻，8000g，25℃離心 10min，取上清液

3 定磷(在 1.5mLEP 管中依次加入下列試劑)

空白管

標(biāo)準(zhǔn)管

對照管

測定管

0.5 mol/ml 標(biāo)準(zhǔn)磷

應(yīng)用液（ L）

100

上清液（ L）

100

100

蒸餾水（ L）

100

定磷試劑（ L）

1000

1000

1000

1000

混勻，室溫放置 30 min，在 660nm 處比色。

注意：

1、由于每一個樣都必須做對照，本試劑盒50管保證測24份 Na+ K+ -ATP 酶。

2、此法具有微量、靈敏、快速的特點。所以對測定所用試管要求嚴(yán)格無磷。

3、空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要做一管。

計算

1、血清（漿）Na+ K+-ATPase 活力的計算:

定義：每小時每毫升血清（漿）中 Na+ K+-ATP 酶分解ATP產(chǎn)生1 mol無機(jī)磷的量為一個酶活力單位。

Na+ K+-ATP酶活力（ mol/h/mL）=[C標(biāo)準(zhǔn)管 V總] （A測定管-A對照管） （A標(biāo)準(zhǔn)管-A

空白管） V 樣 T=7.5 （A 測定管-A 對照管） （A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 Na+ K+-ATPase 活力的計算：

（1）按蛋白濃度計算：

定義：每小時每毫克組織蛋白中 Na+ K+-ATP酶分解ATP產(chǎn)生1 mol無機(jī)磷的量為一個酶活力單位。

Na+ K+-ATP酶活力( mol/h /mg)= [C標(biāo)準(zhǔn)管 V總] （A測定管-A對照管） （A標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管） （Cpr V 樣） T =7.5 （A 測定管-A 對照管） （A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管） Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

定義：每小時每克組織中Na+ K+ -ATP 酶分解ATP產(chǎn)生1 mol無機(jī)磷的量為一個酶活力單位。

Na+ K+-ATP 酶活力( mol/h/g)= [C標(biāo)準(zhǔn)管 V總] （A測定管-A 對照管） （A標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管） (W V 樣 V 樣總) T=7.5 （A 測定管-A 對照管） （A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管） W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

定義：每小時每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞中 Na+ K+-ATP 酶分解ATP產(chǎn)生1 mol無機(jī)磷的量為一個酶活力單位。

Na+ K+-ATP 酶活力( mol/h /104)= [C標(biāo)準(zhǔn)管 V總] （A測定管-A對照管） （A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管） (500 V樣 V樣總) T=0.015 （A測定管-A對照管） （A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）

C 標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.5 mol/mL；V 總：酶促反應(yīng)總體積，0.5mL；V 樣：加入樣本體

積，0.2mL ；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，1/6 小時；Cpr：樣本蛋白質(zhì)

濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。

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