EF39A\K4 2018-01版

黃曲霉毒素B1

快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物黃曲霉毒素B1將和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗黃曲霉毒素B1抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物黃曲霉毒素B1的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出相應殘留物黃曲霉毒素B1的含量。

二、試劑盒特性

試劑盒靈敏度： 0.02ppb孵育溫度： 25℃孵育時間： 30min～15min樣本檢測下限

飼料 大米、玉米、花生、組織、食用油  2 ppb

交叉反應率

黃曲霉毒素B1  100%

黃曲霉毒素M1  6.6%

黃曲霉毒素B2   54.5%

黃曲霉毒素G1  8.4%

黃曲霉毒素G2  1.7%

樣本回收

飼料 大米、玉米、花生、組織、食用油  95 35%

試劑盒組成

1

微量測試孔

每條8孔，一板12條

2

標準液 6瓶

（1ml/瓶）

0ppb

0.02ppb

0.06ppb

0.18ppb

0.54ppb

1.62ppb

3

酶標記物

7ml

紅色帽

4

抗體工作液

7ml

藍色帽

5

底物A液

7ml

白色帽

6

底物B液

7ml

黑色帽

7

終止液

7ml

黃色帽

8

20X濃縮洗滌液

40ml

白色帽

9

20X濃縮復溶液

50ml

透明帽

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：酶標儀、均質器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹儀、恒溫箱、打印機

微量移液器：單道 20～200 l、單道100～1000 l、多道 30～300 l

試 劑：甲醇、正己烷

五、樣本前處理步驟

樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。

樣本前處理需配制：

配液1  樣本復溶液： 

用去離子水將20 濃縮復溶液按1：19稀 

釋（1份20 濃縮復溶液+19份去離子水）。

配液2  樣本提取液： 

將甲醇與去離子水按7:3比例混合均勻（7份甲醇+3份去離子水）。

樣本處理： 

（a）組織、飼料、大米、玉米樣本處理方法：

取1.0 0.05g研碎的樣本于50ml離心管中；加入5ml樣本提取液，充分振蕩3min，20℃ 4000r/min以上離心10min；取上清100 l，加入700 l樣本復溶液，充分振蕩混勻；取50 l用于分析。

 樣本稀釋倍數(shù)：40倍 

（b）食用油樣本處理方法：

取1.0 0.05g食用油樣本于50ml離心管中；加入5ml樣本提取液，再加入4ml正己烷，充分振蕩3min，20℃ 4000r/min以上離心10min；去掉上清，取中間層液體100 l，加入700 l樣本復溶液，充分振蕩混勻；取50 l用于分析。

 樣本稀釋倍數(shù)：40倍 

（c）花生樣本處理方法：

 取1.0 0.05g研碎的花生樣本于50ml離心管

 中；加入5ml樣本提取液，再加入4ml正己

 烷，充分振蕩3min，20℃ 4000r/min以上離

 心10min；

 去掉上清，取中間層液體100 l，加入400 l

 樣本復溶液，充分振蕩混勻；

3.  取50 l用于分析

 樣本稀釋倍數(shù)：25倍 

六、 酶標免疫分析程序:

測定前應須知：使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。操作步驟：從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2～8℃。配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。加標準品/樣本50 l/孔到各自的微孔中，然后加酶標記物50 l/孔，再加入50 l/孔的抗體工作液，用蓋板膜蓋板，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境反應30min。將孔內液體甩干，用稀釋后的洗滌液250 l/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。顯色：加入底物A液50 l/孔，再加入底物B液50 l/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。測定：加入終止液50 l/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內讀數(shù)），測定每孔OD值。

七、結果判定

結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含黃曲霉毒素B1量成負相關。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標準液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 0.02pb為1.816；0.06ppb為1.415；0.18ppb為0.74；0.54ppb為0.313；1.62ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是0.54ppb～1.62ppb；樣本2的濃度范圍是0.06ppb～0.18ppb，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中黃曲霉毒素B1實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光率（%）＝

B

100%

B0

B 標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0 0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪制與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，以黃曲霉毒素B1標準品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中黃曲霉毒素B1實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。

八、 注意事項

室溫低于25℃或試劑及標本未回到室溫（20～25℃）會導致所有標準的OD值偏低。在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作?；旌弦鶆?，否則會出現(xiàn)重復性不好的現(xiàn)象。反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。標準品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質。該試劑盒理想反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲藏條件和保質期

儲藏條件：試劑盒于2～8℃保存，不要冷凍。保 質 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。

提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結果，請放心使用。

 

農(nóng)業(yè)部生物毒素檢測重點實室

聯(lián)合研制

 

 

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