什么是拉曼

光照射到物質(zhì)上發(fā)生彈性散射和非彈性散射. 彈性散射的散射光是與激發(fā)光波長相同的成分，成為瑞利散射；非彈性散射的散射光有比激發(fā)光波長長的和短的成分, 稱為拉曼散射（斯托克斯及反斯托克斯拉曼散射）。拉曼散射大約只占散射光的千萬分之一，這些散射散布到四面八方，而且它們的波長和偏振態(tài)都會(huì)發(fā)生改變。
拉曼效應(yīng)是光子與光學(xué)支聲子相互作用的結(jié)果，源于分子振動(dòng)（和點(diǎn)陣振動(dòng)）與轉(zhuǎn)動(dòng)，因此從拉曼光譜中可以得到分子振動(dòng)能級（點(diǎn)陣振動(dòng)能級）與轉(zhuǎn)動(dòng)能級結(jié)構(gòu)的信息。
斯托克斯拉曼散射光子能量比瑞利散射光子能量弱，即斯托克斯拉曼散射光的波長比瑞利散射光的波長長；而反斯托克斯拉曼散射光子具有更高的能量。反斯托克斯譜線強(qiáng)度比斯托克斯譜線強(qiáng)度弱得多，這是因?yàn)橹挥刑幱谡駝?dòng)激發(fā)態(tài)的分子引起的輻射才能產(chǎn)生反斯托克斯譜線。相對來說，在拉曼實(shí)驗(yàn)中，斯托克斯譜線更容易被測量到。

幾種常見的拉曼技術(shù)

共振拉曼(RRS) 

如果激光的波長和分子的電子吸收相吻合，這一分子的某個(gè)或幾個(gè)特征拉曼譜帶強(qiáng)度將增至100-10,000 倍以上，并觀察到正常拉曼效應(yīng)中難以出現(xiàn)的、其強(qiáng)度可與基頻相比擬的泛音及組合振動(dòng)光譜。這種共振增強(qiáng)或共振拉曼效應(yīng)非常有用，不僅能顯著降低檢測限，而且可引入電子選擇性。由于共振拉曼能提供結(jié)構(gòu)及電子等信息，因此，共振拉曼也被用于物質(zhì)鑒定。

紫外共振拉曼(UVRRS) 

熒光干擾問題和靈敏度較低嚴(yán)重阻礙了常規(guī)拉曼光譜的廣泛應(yīng)用。但近年來發(fā)展起來的紫外拉曼光譜技術(shù)有效地解決了上述問題。紫外拉曼光譜技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展大大地?cái)U(kuò)展了拉曼光譜的應(yīng)用范圍。右圖是紫外拉曼光譜避開熒光干擾的原理圖。熒光往往出現(xiàn)在300 nm-700 nm 區(qū)域，或者更長波長區(qū)域。而在紫外區(qū)的某個(gè)波長以下，熒光極少出現(xiàn)。因此，對于許多在可見拉曼光譜中存在強(qiáng)熒光干擾的物質(zhì)，例如氧化物、積碳等， 通過利用紫外拉曼光譜技術(shù)就可以成功的避開熒光從而得到信噪比較高的拉曼譜圖。從下圖磷酸鋁分子篩ALPO-5 示例可以看出，紫外共振拉曼光譜技術(shù)由于能避開熒光，可以成功用于微孔和介孔分子篩材料的表征。

紫外拉曼光譜技術(shù)的另一個(gè)突出特點(diǎn)是，拉曼信號可以通過共振拉曼信號得到增強(qiáng)。共振拉曼效應(yīng)可以從拉曼散射截面公式得到解釋：根據(jù)Kramers-Heisenberg-Dirac 散射公式:

 
在公式 (1) 中，ωri 是初始態(tài)i 到激發(fā)態(tài)r 的能量差頻率，ωL 是入射激光頻率。當(dāng)激發(fā)光源頻率靠近電子吸收帶時(shí)，第一項(xiàng)分母趨近于零，因而其散射截面異常增大, 導(dǎo)致某些特定的拉曼散射強(qiáng)度增加104~106 倍。共振拉曼光譜的譜峰強(qiáng)度隨著激發(fā)線的不同而呈現(xiàn)出與普通拉曼不同的變化。

紫外拉曼光譜規(guī)避熒光成功表征AIPO-5 分子篩的信號

將紫外共振拉曼用于表征多組份體系時(shí)，可以選擇性的激發(fā)某些組分相應(yīng)的信息，從而使與這些組分相關(guān)的拉曼信號大大增強(qiáng)，得到共振拉曼光譜
這種共振增強(qiáng)或者共振拉曼效應(yīng)是非常有用的一個(gè)技術(shù)，它不僅可以極大的降低拉曼測量的探測極限，而且還可以引入到電子選擇上面。這樣，如果我們使用共振拉曼技術(shù)來研究樣品，不僅可以看到它的結(jié)構(gòu)特征，而且還可以得到它的電子結(jié)構(gòu)信息。金屬卟啉， 類胡蘿卜素以及其他一系列生物重要分子的電子能級之間躍遷能量差都處在可見光范圍之內(nèi)，這使得它們成了共振拉曼光譜的理想研究材料。

拉曼散射和共振拉曼散射的能級圖以及它們對應(yīng)拉曼譜圖示意圖

共振選擇技術(shù)還有一個(gè)非常實(shí)際的應(yīng)用。那就是二分之一載色體的光譜由于這種共振作用會(huì)得到增強(qiáng)，而它周圍的環(huán)境則不會(huì)。對于生物染色體來說這就意味著，我們使用可見光即可特定的探測到有源吸收中心，而它們周圍的蛋白質(zhì)陣列則不會(huì)對探測產(chǎn)生影響（這是因?yàn)檫@些蛋白質(zhì)需要紫外光才能使其產(chǎn)生共振增強(qiáng)作用）。共振拉曼光譜在化學(xué)上探測金屬中心合成物，富勒分子，聯(lián)乙醯以及其他的稀有分子上也是一種重要的技術(shù)，因?yàn)檫@些材料對于可見光都有著很強(qiáng)的吸收。

其他更多的分子吸收光譜由于處于紫外，所以需要紫外激光進(jìn)行共振激發(fā)，我們就稱之為紫外共振拉曼（Ultra Violet Resonance Raman Spectroscopy）; 紫外共振拉曼光譜技術(shù)是研究催化和復(fù)雜生物系統(tǒng)中分子分析的一個(gè)重要工具。大多數(shù)的生物系統(tǒng)都吸收紫外輻射， 所以它們都能提供紫外的共振拉曼增強(qiáng)。這樣高的共振拉曼共振選擇效應(yīng)使得像蛋白質(zhì)和DNA 等重要生物目標(biāo)的拉曼光譜得到極大增強(qiáng)， 而其他物質(zhì)則不會(huì)，非常便于目標(biāo)確認(rèn)及分析。例如，200nm 的激發(fā)光能夠增強(qiáng)氨基化合物的振動(dòng)峰；而220nm 的激發(fā)光則可以增強(qiáng)特定的芳香族殘留物的振動(dòng)峰。水中的拉曼散射非常弱，這個(gè)技術(shù)使得與水有關(guān)的微弱系統(tǒng)的拉曼分析也變成了可能。

金屬卟啉、類胡蘿卜素以及其他幾類重要的生物分子在可見光區(qū)域內(nèi)有強(qiáng)烈的電子躍遷，因此他們成了理想的共振拉曼光譜檢測對象。

表面增強(qiáng)拉曼（SERS）

自1974 年Fleischmann 等人發(fā)現(xiàn)吸附在粗糙化的Ag 電極表現(xiàn)的吡啶分子具有巨大的拉曼散射現(xiàn)象，加之活性載體表面選擇吸附分子對熒光發(fā)射的抑制，激光拉曼光譜分析的信噪比大大提高，這種表面增強(qiáng)效應(yīng)被稱為表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)。
拉曼散射由化合物（或離子）的散射吸附，或在結(jié)構(gòu)化金屬表面，可達(dá)到溶液中散射的103 倍到106 倍。這種表面增強(qiáng)拉曼散射在銀表面表現(xiàn)得強(qiáng)，在金或銅表面也比較強(qiáng)。其他金屬則沒有這么強(qiáng)的增強(qiáng)效應(yīng)。

表面增強(qiáng)效應(yīng)產(chǎn)生的兩個(gè)機(jī)制：

第一種是在貴金屬表面產(chǎn)生一種增強(qiáng)的電磁場。當(dāng)入射光的波長接近金屬等離子體波長時(shí)，金屬表面?zhèn)鲗?dǎo)電子被激發(fā)到一個(gè)擴(kuò)展表面的電子激發(fā)態(tài)，稱為表面等離子體共振。分子吸附在表面或接近表面經(jīng)過一個(gè)異常大的電磁場。垂直于表面的振動(dòng)模式帶來的增強(qiáng)強(qiáng)烈。
第二種是是在表面和分析物分子之間形成電荷轉(zhuǎn)移絡(luò)合物。許多電荷轉(zhuǎn)移絡(luò)合物帶來的電子躍遷會(huì)產(chǎn)生可見光，以便發(fā)生增強(qiáng)諧振。

顯微共聚焦拉曼（Confocal）

共焦：從一個(gè)點(diǎn)光源發(fā)射的探測光通過透鏡聚焦到被觀測物體上，如果物體恰在焦點(diǎn)上，那么反射光通過原透鏡應(yīng)當(dāng)匯聚回到光源， 這就是所謂的共聚焦，簡稱共焦。共焦指的是空間濾波的能力和控制被分析樣品的體積的能力，通常是利用顯微鏡系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)的。只有顯微鏡系統(tǒng)的無限遠(yuǎn)光路才可以實(shí)現(xiàn)良好的共焦性能。
顯微拉曼光譜技術(shù)是將拉曼光譜分析技術(shù)與顯微分析技術(shù)結(jié)合起來的一種應(yīng)用技術(shù)。與其他傳統(tǒng)技術(shù)相比，更易于直接獲得大量有價(jià)值信息，共聚焦顯微拉曼光譜不僅具有常規(guī)拉曼光譜的特點(diǎn)，還有自己的獨(dú)特優(yōu)勢，樣品區(qū)接近衍射極限（約1 微米）；成像和光譜可以被組合以產(chǎn)生“拉曼立方體”三維數(shù)據(jù)，在二維圖像的每個(gè)像素對應(yīng)一個(gè)拉曼頻譜信息。
從光學(xué)結(jié)構(gòu)來說，顯微共聚焦拉曼光譜儀主要有針孔共聚焦和“狹縫-CCD”共聚焦兩種設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)。
先進(jìn)的“狹縫+CCD 焦平面共焦”技術(shù)，具有較高通光效率，高靈敏度，操作簡單。
原理：顯微鏡頭聚焦到樣品上，將顯微鏡頭收集的樣品信號聚焦到光譜儀狹縫入口，通過狹縫對焦平面的一維（X 方向）限制進(jìn)入光譜儀； 經(jīng)光譜儀分光，光譜成像在CCD 上；在通過對CCD 上像元的提取， 對另一維（Y 方向）的信號的限制，提取出樣品上的信號，實(shí)現(xiàn)共焦作用。“狹縫+CCD 焦平面共焦”技術(shù)特點(diǎn)：
1、 共焦區(qū)域任意設(shè)置（狹縫寬度，CCD 像元區(qū)域任意設(shè)定）。
2、 全部信號進(jìn)入光譜儀，沒有信號損失。
采用“狹縫+CCD焦平面共焦”技術(shù)的Finder Vista（“微曼”共聚焦拉曼顯微鏡）空間分辨率指標(biāo)：
 X，Y方向空間分辨率：1um
 Z方向空間分辨：2um

典型拉曼光譜系統(tǒng)架構(gòu)

典型拉曼光譜系統(tǒng)由如下幾個(gè)部分構(gòu)成：

 激發(fā)光源。通常采用激光器，要求單色性好、功率大并且最好能選擇多個(gè)工作波長。
 激發(fā)光路。包含聚焦、匯聚、濾光等多個(gè)功能元件以及樣品調(diào)節(jié)裝置。
 光譜儀?？蒲屑壍南到y(tǒng)中通常采用高分辨率光譜儀， 推薦采用影像校正光譜儀，可以進(jìn)一步提升系統(tǒng)的檢測性能。
 探測器。通常采用CCD探測器或高靈敏度的PMT（配合光子計(jì)數(shù)器等高靈敏電子學(xué)設(shè)備）。
 數(shù)據(jù)處理單元。包括計(jì)算機(jī)和軟件。

拉曼光譜應(yīng)用

拉曼光譜能給出的物質(zhì)信息