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倒置熒光顯微鏡的構成|原理|用途
倒置熒光顯微鏡是近代發(fā)展起來的新式熒光顯微鏡所屬光學儀器的一種，特點是激發(fā)光從物鏡向下落射到標本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡。倒置熒光顯...[查看全部]
熒光顯微鏡是利用特定波長的光，照射被檢物體產生熒光進行鏡檢的光學觀測儀器，已有100多年歷史。熒光顯微鏡是在復式顯微鏡上安裝熒光裝置集合而成，熒光裝置包括熒光光源、激發(fā)光光路、激發(fā)/發(fā)射濾光片組件等器件。
熒光顯微鏡工作原理熒光顯微鏡是醫(yī)院科研、病理、檢驗等部門常用的醫(yī)用光學儀器之一。因為普通的顯微鏡是在明亮的背景上觀察暗物，而熒光顯微鏡是在暗背景下觀察彩色的圖像，因此它比普通的顯微鏡分辨力提高100倍，可以觀察到普通顯微鏡看不到的細節(jié)。但是它的調整，校正難度較高，只要解決了熒光顯微鏡的問題，其它顯微鏡問題就迎刃而解。
下圖是熒光顯微鏡的光學系統(tǒng)圖。由汞燈發(fā)出的各種譜線的光線，經激發(fā)濾光片后只讓某一種波長的紫外光線通過，如波長為404.7nm藍紫光，經反光鏡后，激發(fā)樣品產生熒光。激發(fā)濾光片將其他波長的光線濾掉，并使樣品激發(fā)熒光，所以稱其為激發(fā)濾光片。通常，激發(fā)產生的熒光波長比激發(fā)樣品的光的波長大得多，是可見光。這樣產生的熒光和透過樣品的一部分激發(fā)光(紫外光)，經物鏡成像后，人眼即可用目鏡觀察熒光圖像。為了防止紫外光進入目鏡視場，降低圖像襯度和損傷人眼，放置了一塊截止濾光片，它只讓某一部分波長的譜線通過，如只讓500～750nm的可見光通過，而不讓500nm以下的光通過。
從圖中可以看出，光源是熒光顯微鏡主要組成部分，熒光顯微鏡都采用200W的超高壓汞燈作光源。它是由石英玻璃制作，中間呈球形，內充有一定量的汞，工作時在兩極間放電，引起水銀蒸發(fā)，球內氣壓迅速升高，當水銀完全蒸發(fā)時，可達50～70個標準大氣壓力，這一過程一般約5～15min。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子在不斷解離和還原過程中發(fā)射光量子的結果。它發(fā)射很強的紫光，足以激發(fā)各類熒光物質，因此被熒光顯微鏡普遍采用。
熒光顯微鏡的激發(fā)熒光方式熒光顯微鏡是免疫熒光組織化學的基本工具。它是由超高壓光源、濾
... 查看全文熒光顯微鏡是免疫熒光細胞化學的基本工具，由光源、濾板系統(tǒng)和光學系統(tǒng)等主要部件組成。熒光顯微鏡利用一定波長的光激發(fā)標本發(fā)射熒光，通過物鏡和目鏡系統(tǒng)放大以觀察標本的熒光圖像。
一、光源：
熒光顯微鏡多采用200W的超高壓汞燈作光源，它是用石英玻璃制作，中間呈球形，內充一定數量的汞，工作時由兩個電極間放電，引起水銀蒸發(fā)，球內氣壓迅速升高，當水銀完全蒸發(fā)時，可達50～70個標準大氣壓力，這一過程一般約需5～15min。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過程中發(fā)射光量子的結果。它發(fā)射很強的紫外和藍紫光，足以激發(fā)各類熒光物質，因此，為熒光顯微鏡普遍采用。超高壓汞燈也散發(fā)大量熱能。因此，燈室必須有良好的散熱條件，工作環(huán)境溫度不宜太高。
超高壓汞燈在使用初期不需高電壓即可引燃，使用一些時間后，則需要高壓啟動(約為15000V)，啟動后，維持工作電壓一般為50～60V，工作電流約4A左右。200W超高壓汞燈的平均壽命，在每次使用2h的情況下約為200h，開動一次工作時間愈短，則壽命愈短，如開一次只工作20min，則壽命降低50%。
因此，使用熒光顯微鏡時盡量減少啟動次數。燈泡在使用過程中，其光效是逐漸降低的。燈熄滅后要等待冷卻才能重新啟動。點燃燈泡后不可立即關閉，以免水銀蒸發(fā)不完全而損壞電極，一般需要等15min。由于超高壓汞燈壓力很高，紫外線強烈，因此燈泡必須置燈室中方可點燃，以免傷害眼睛和發(fā)生爆炸時造成操作者受傷。
二、濾色系統(tǒng)：
濾色系統(tǒng)是熒光顯微鏡的重要部位，由激發(fā)濾板和壓制濾板組成。濾板型號，各廠家名稱常不統(tǒng)一。濾板一般都以基本色調命名，前面字母代表色調，后面字母代表玻璃，數字代表型號特點。
1、激發(fā)濾板：根據光源和熒光色素的特點，提供一定波長范圍的激發(fā)光。
紫外光激發(fā)濾板：此濾板可使400nm以下的紫外光透過，阻擋400nm以上的可見光通過。
... 查看全文熒光顯微鏡是光學顯微鏡的一種，是免疫熒光細胞化學的基本工具。以紫外線為光源，用以照射被檢物體，使之發(fā)出熒光，然后觀察物體的形狀及其所在位置。用于研究細胞內物質的吸收、運輸、化學物質的分布及定位等。
熒光顯微鏡的發(fā)展自從1590年詹森父子發(fā)明顯微鏡以來，已有400多年的歷史。顯微鏡的發(fā)展一直是以提高圖像的對比度和分辨力為主要目標。
熒光顯微鏡是以紫外光或藍紫單色光激發(fā)標本來產生熒光，因為紫外光不可見，故由標本發(fā)出的熒光與背景反差很大，即熒光顯微鏡通常在黑暗的背景下觀察彩色的圖像;而普通顯微鏡是在明亮的背景下觀察較暗的樣品。這樣熒光顯微鏡的對比度比普通顯微鏡提高約100倍，因此可觀察到普通顯微鏡下看不到的結構細節(jié)。熒光顯微鏡具有對比度高這個突出的優(yōu)點，得到了廣泛的應用。
透射式熒光顯微鏡：
下圖(a)是透射式熒光顯微鏡的原理圖。由汞燈發(fā)出的各種譜線的光線，經激發(fā)濾光片后只讓某一種波長的紫外光線通過，如波長為404.7nm藍紫光，經反光鏡后，激發(fā)樣品產生熒光。這個濾光片將其它波長的光線濾掉，并使樣品激發(fā)熒光，所以稱激發(fā)濾光片。
通常，熒光波長比激發(fā)樣品的光的波長大得多，是可見光。這樣產生的熒光和透過樣品的一部分激發(fā)光(紫外光)，經物鏡成像后，人眼即可用目鏡觀察熒光圖像。為了防止紫外光進人目鏡視場，降低圖像材度和損傷人眼，安放了一塊截止濾光片，它只讓某一部分波長的譜線通過，如只讓500～750nm的可見光通過，而不讓500nm以下的光通過，所以稱為截止濾光片。
反射式熒光顯微鏡：
上圖(b)是反射式熒光顯微鏡的原理圖。反射式熒光顯微鏡和透射式熒光顯微鏡的原理類同。
反射式熒光顯微鏡有下列優(yōu)點：
①光能的利用率高。在反射式熒光顯微鏡中，激發(fā)光直接照射在標本的觀察表面;而在透射式熒光顯微鏡中，激發(fā)光穿過具有一定厚度的標本后才抵達觀察表面，能量被衰減
... 查看全文熒光顯微鏡是以紫外線為光源，用以照射被檢物體，使之發(fā)出熒光，然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。熒光顯微鏡用于研究細胞內物質的吸收、運輸、化學物質的分布及定位等。
熒光顯微鏡的使用方法1、用窗簾遮蔽光線，關閉房間內的電燈，除去熒光顯微鏡的防塵罩，確保熒光顯微鏡燈室通風良好、無遮蓋。裝上汞燈燈箱，并轉動燈箱卡圈上的撥桿，將燈箱與鏡臂連接。
2、將汞燈燈箱的電源插頭插入熒光電源箱后的插座，再將熒光電源箱的插頭插入220V外接電源。
3、打開熒光顯微鏡電源開關，電壓表顯示出電源電壓，如電源電壓波動不大于額定電壓值的5%，即可按下啟動開關點燃汞燈，如因天氣太冷或電壓不穩(wěn)定等原因，一次啟動未點燃汞燈，可以多按幾次。待超高壓汞燈弧光達到穩(wěn)定狀態(tài)并達到最大發(fā)光效率，即可開始工作。
4、燈泡的調中：
①任選一塊標本放在熒光顯微鏡載物臺上。
②轉動鏡臂上的聚光鏡旋鈕使聚光鏡移出光路，轉動濾色片組轉換手輪，將紫光(V)或藍光(B)或綠光(G)激發(fā)濾色片組轉入光路，并將25熒光物鏡轉入光路。
③調節(jié)粗微調手輪，將標本像調焦清晰。
④前后推動垂直照明器右邊的聚光鏡調焦推桿，使視場光欄成像清晰，轉動視場光欄撥桿將視場光欄收小，調節(jié)視場光欄調中螺釘使視場光欄居中，然后再將視場光欄開至最大。
⑤轉動鏡臂上的聚光鏡旋鈕使聚光鏡移入光路，前后調節(jié)燈箱上的聚光鏡撥桿，使汞燈的弧光在視場內成像清晰。
⑥調整燈箱上的燈泡水平調節(jié)螺釘和垂直調節(jié)螺釘，使汞燈的弧光居中。
⑦調整反光鏡水平調節(jié)螺釘和垂直調節(jié)螺釘，使光源的反射像與汞燈的弧光分開。
⑧轉動聚光鏡旋鈕把聚光鏡移出光路，此時視場照明均勻。
5、熒光觀察：
①將熒光染色標本放到熒光顯微鏡載物臺上。
②將10x平場物鏡或25x熒光物鏡轉入光路，調節(jié)載物臺縱橫移動手輪，將標本移入光路。
③轉動濾光片轉換撥輪，將熒光染色標本所
... 查看全文熒光顯微鏡是以紫外線為光源，用以照射被檢物體，使之發(fā)出熒光，然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。熒光顯微鏡是基于熒光成像進行光度分析的光學測量儀器，廣泛用于生命科學研究和臨床實驗室診斷等領域。
熒光顯微鏡的校準熒光顯微鏡比普通顯微鏡復雜，使用也比較麻煩，但只要注意下面幾點，用戶自行作些校準還是很容易的。
1、汞燈的校準
基于熒光顯微鏡的原理，決定了選用汞燈作為其光源。由于標本產生的熒光比較弱，為了得到較亮的圖像，汞燈的校準至關重要。具體校準步驟如下：
①開啟汞燈后，在熒光顯微鏡工作臺上放一張白紙，并從物鏡轉換器中轉出物鏡，即轉換器上出現(xiàn)的空孔位于光軸上，卸去轉換器上保護蓋(如無空孔，可卸掉一個低倍物鏡，校準完畢后再旋上)。轉動熒光顯微鏡主體內的濾光片座，選一個透過綠光的濾光片組，使反射照明有光通過物鏡轉換器孔，此時在白紙上可以看到汞燈照亮的光斑。如光斑太亮，可以插入中性濾光片，或帶上太陽眼鏡，以保護眼睛。
②轉動聚光鏡調焦旋手，使汞燈光弧在白紙上成像清晰。因汞燈室內裝有一個球面反光鏡，用來增加亮度，于是在白紙上看到兩個光弧的像。旋轉汞燈調節(jié)旋手和反光鏡位置調節(jié)旋手，使兩個光弧并立。再轉動反光鏡聚焦調節(jié)旋手，使兩個光弧有接近相等的亮度。
③旋轉汞燈調節(jié)旋手和反光鏡位置調節(jié)旋手，使兩個光弧重合。再調節(jié)聚光鏡調焦旋手，得到放大和均勻的光弧像。這樣汞燈校準工作就完成了。轉入物鏡后，根據物鏡具體倍率，稍微調節(jié)一下聚光鏡調焦旋手就可以了。
2、孔徑光闌和視場光闌的校準
一般熒光顯微鏡均采用柯勒照明。所謂柯勒照明是一種能夠得到圖像最大對比和最大分辨的折中方法。這時，燈絲成像在孔徑光闌上，一般也成像在物鏡最后一片鏡框上?？讖焦怅@是限制光源大小的光闌，而視場光闌是限制人眼在目鏡里看到視野大小的光闌。只有在正確校準柯勒照明的條件下，熒光顯微鏡才能獲得它的最佳光學性能。
... 查看全文倒置熒光顯微鏡是近代發(fā)展起來的新式熒光顯微鏡所屬光學儀器的一種，特點是激發(fā)光從物鏡向下落射到標本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡。
倒置熒光顯微鏡的構成倒置熒光顯微鏡由熒光附件與倒置顯微鏡有機結合構成的，主要用于細胞等活體組織的熒光、相差觀察。
倒置顯微鏡是為了適應生物學、醫(yī)學等領域中的組織培養(yǎng)、細胞離體培養(yǎng)、浮游生物、環(huán)境保護、食品檢驗等顯微觀察。由于這些活體被檢物體均放置在培養(yǎng)皿(或培養(yǎng)瓶)中，這樣就要求倒置顯微鏡的物鏡和聚光鏡的工作距離很長，能直接對培養(yǎng)皿中的被檢物體進行顯微觀察和研究。因此，物鏡、聚光鏡和光源的位置都顛倒過來，故稱為“倒置顯微鏡”。
倒置顯微鏡多用于無色透明的活體觀察，在倒置顯微鏡的基礎上添加一套熒光附件：激光激發(fā)塊，熒光光源，熒光照明器，激發(fā)塊切換裝置，即可進行倒置熒光觀察。
倒置熒光顯微鏡是近代發(fā)展起來的新式熒光顯微鏡所屬光學儀器的一種，是激發(fā)光從物鏡向下落射到標本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡。光路中需加上一個雙色束分離器，它與光軸呈45°角，激發(fā)光被反射到物鏡中，并聚集在樣品上，樣品所產生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時進入物鏡，反回到雙色束分離器，使激發(fā)光和熒光分開，殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發(fā)濾片/雙色束分離器/阻斷濾片的組合插塊，可滿足不同熒光反應產物的需要。此種熒光顯微鏡的優(yōu)點是視野照明均勻，成像清晰，放大倍數愈大熒光愈強。
倒置熒光顯微鏡適用于對活體細胞和組織、流質、沉淀物等進行顯微研究，是生物學，細胞學，腫瘤學，遺傳學，免疫學等研究工作的理想儀器?？晒┛蒲?、高校、醫(yī)療、防疫和農牧等部門使用。倒置熒光顯微鏡是由倒置顯微鏡和落射熒光顯微鏡組成。儀器配有長工作距離平場消色差物鏡、大視野目鏡、雙目觀察，倒置顯微鏡還配有特長或超長工作距
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