流式細胞術(shù)的歷史

概要說來，流式細胞術(shù)主要包括了樣品的液流技術(shù)、細胞的分選和計數(shù)技術(shù)，以及數(shù)據(jù)的采集和分析技術(shù)等。FCM目前發(fā)展的水平凝聚了半個世紀以來人們在這方面的心血和成果。

1934年，Moldavan1首次提出了使懸浮的單個血紅細胞等流過玻璃毛細管，在亮視野下用顯微鏡進行計數(shù)，并用光電記錄裝置計測的設(shè)想，在此之前，人們還習(xí)慣于丈量靜止的細胞，由于要使單個細胞順次流過狹窄管道輕易造成較大的細胞和細胞團塊的淤阻。1953年Crosland–Taylor根據(jù)雷諾對牛頓流體在圓形管中活動規(guī)律的研究熟悉到：管中軸線流過的鞘液流速越快，載物通過的能力越強，并具有較強的流體動力聚集作用。于是設(shè)計了一個活動室，使待分析的細胞懸浮液都集聚在圓管軸線四周流過，外層包圍著鞘液;細胞懸浮液和鞘液都在作層液。這就奠定了現(xiàn)代流式細胞術(shù)中的液流技術(shù)基礎(chǔ)。

1956年，Coulter在多年研究的基礎(chǔ)上利用Coulter效應(yīng)生產(chǎn)了Coulter計數(shù)器。其基本原理是：使細胞通過一個小孔，只在細胞與懸浮的介質(zhì)之間存在著導(dǎo)電性上的差異，便會影響小孔道的電阻特性，從而形成電脈沖信號，丈量電脈沖的強度和個數(shù)則可獲得有關(guān)細胞大小和數(shù)目方面的信息。1967年Holm等設(shè)計了通過汞弧光燈激發(fā)熒光染色的細胞，再由光電檢測設(shè)備計數(shù)的裝置。1973年Steinkamp設(shè)計了一種利用激光激發(fā)雙色熒光色素標記的細胞，既能分析計數(shù)，又能進行細胞分選的裝置。這樣就基本完成了現(xiàn)代FCM計數(shù)技術(shù)的主要歷程。

現(xiàn)代的FCM數(shù)據(jù)采集和分析技術(shù)是從組織化學(xué)起源的，其開拓者是Kamentsky。1965年，Kamentsky在組織化學(xué)的基礎(chǔ)上提出了兩個新設(shè)想：(1)細胞的組分是可以用光光度學(xué)來定量測定的，即分光光度術(shù)可以定量地獲得有關(guān)細胞組織化學(xué)的重要信息。(2)細胞的不同組分可以同時進行多參數(shù)丈量，從而可以對細胞進行分類。換句話說，對同一細胞可以同時獲得有關(guān)不同組分的多方面信息，用作鑒別細胞的依據(jù)。

流式細胞術(shù)在細胞化學(xué)中的應(yīng)用的先驅(qū)者是VanDilla和美國的LosAlamos小組。他們在1967年研制出流液束、照明光軸、檢測系統(tǒng)光軸三者相互正交的流式細胞計的基礎(chǔ)上，首次用熒光Feulgen反應(yīng)對DNA染色顯示出DNA的活性與熒光之間存在著線性關(guān)系，并在DNA的直方圖上清楚地顯示出細胞周期的各個時相。Gohde和Dittrich接著把這項技術(shù)推向?qū)嵱?，他們用流式細胞術(shù)測定細胞周期借以研究細胞藥代動力學(xué)題目。FCM用于免疫組織化學(xué)中的關(guān)鍵是對細胞進行免疫熒光染色，其它和在細胞化學(xué)的應(yīng)用并沒有多大差異。(下圖為一DNA直方圖)

將待測細胞染色后制成單細胞懸液。

用一定壓力將待測樣品壓進活動室，不含細胞的磷酸緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管進口方向與待測樣品流成一定角度，這樣，鞘液就能夠包繞著樣品高速活動，組成一個圓形的流束，待測細胞在鞘液的包被下單行排列，依次通過檢測區(qū)域。

流式細胞儀通常以激光作為發(fā)光源。經(jīng)過聚焦整形后的光束，垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細胞在激光束的照射下，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。

(如下圖：FSC SSC)

前向角散射，即FSC與細胞直徑平分正相關(guān)，所以我們平時上機的時候，有時用FSC做閾值，排除碎片及其它顆粒，避免干擾。

側(cè)向角散射，即SSC是指與激光束正交90度方向的散射信號，它對細胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更敏感，可以提供細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)及顆粒性質(zhì)的信息!

因此，僅根據(jù)FSC/SSC，我們就可以分開全血樣本中的淋巴細胞，單核細胞和中性粒細胞!(如下圖)

這兩種信號同時被前向光電二極管和90°方向的光電倍增管接收。光散射信號在前向小角度進行檢測，這種信號基本上反映了細胞體積的大小;熒光信號的接受方向與激光束垂直，經(jīng)過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號。

這些熒光信號的強度代表了所測細胞膜表面抗原的強度或其核內(nèi)物質(zhì)的濃度，經(jīng)光電倍增管接收后可轉(zhuǎn)換為電信號，再通過模/數(shù)轉(zhuǎn)換器，將連續(xù)的電信號轉(zhuǎn)換為可被計算機識別的數(shù)字信號。計算機把所丈量到的各種信號進行計算機處理，將分析結(jié)果顯示在計算機屏幕上，液可以打印出來，還可以數(shù)據(jù)文件的形式存儲在硬盤上以備日后的查詢或進一步分析。(下圖為光學(xué)系統(tǒng))

檢測數(shù)據(jù)的顯示視丈量參數(shù)的不同由多種形式可供選擇。

單參數(shù)數(shù)據(jù)以直方圖的形式表達，其X軸為丈量強度，Y軸為細胞數(shù)目。一般來說，流式細胞儀坐標軸的分辨率有512或1024通道數(shù)，這視其模數(shù)轉(zhuǎn)換器的分辨率而定。

對于雙參數(shù)或多參數(shù)數(shù)據(jù)，既可以單獨顯示每個參數(shù)的直方圖(histogram)，也可以選擇二維的散點圖(dotplot)、等高線圖(contour)或三維立體視圖(pseudo3D)。

(上面有一個直方圖了，下圖為散點圖及三維立體圖)

細胞的分選是通過分離含有單細胞的液滴而實現(xiàn)的。在活動室的噴口上配有一個超高頻電晶體，充電后振動，使噴出的液流斷裂為均勻的液滴，待測定細胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正負不同的電荷，當(dāng)液滴流經(jīng)帶有幾千伏特的偏轉(zhuǎn)板時，在高壓電場的作用下偏轉(zhuǎn)，落進各自的收集容器中，不予充電的液滴落進中間的廢液容器，從而實現(xiàn)細胞的分離。也就是高中學(xué)過的帶電粒子在電場中運動的原理!