分離純化由各種化學(xué)工程的單元操作組成。由于生物產(chǎn)品品種多，性質(zhì)各異，故用到的單元操作很多，其中如吸附、萃取、蒸餾、蒸發(fā)和干燥等屬傳統(tǒng)的單元操作，理論比較成熟。一般說(shuō)來(lái)，分離純化可分為四個(gè)階段：①發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離;②初步分離(提取);③高度純化(精制);④成品加工。

生物學(xué)科的發(fā)展日新月異，基因工程、動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)、傳統(tǒng)發(fā)酵工程和酶工程等新技術(shù)、新產(chǎn)品層出不窮，這些新產(chǎn)品的獲得均離不開(kāi)各種分離手段的應(yīng)用。隨著對(duì)產(chǎn)品純度和質(zhì)量愈來(lái)愈高的要求以及科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分離純化技術(shù)也不斷得到發(fā)展。

1、古代釀造業(yè)

古代釀造業(yè)包括釀酒，制醬(油)、醋、酸奶和干酪等，技術(shù)原始，多屬家庭式作坊，產(chǎn)物基本不經(jīng)過(guò)后處理而直接使用，基本無(wú)下游技術(shù)。

2、第一代生物技術(shù)

主要指19世紀(jì)60年代~20世紀(jì)40年代青霉素等抗生素出現(xiàn)之前的生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)。這期間發(fā)現(xiàn)了發(fā)酵的本質(zhì)是微生物的作用，掌握了純種培養(yǎng)技術(shù)，生物技術(shù)進(jìn)入近代釀造產(chǎn)業(yè)的發(fā)展階段。

到20世紀(jì)上半葉，逐漸開(kāi)發(fā)形成了發(fā)酵法生產(chǎn)酒精、丙酮、丁醇等微生物發(fā)酵工業(yè)(主要是厭氧發(fā)酵)，其產(chǎn)品相對(duì)簡(jiǎn)單，基本上是無(wú)活性的小分子。此時(shí)開(kāi)始引入過(guò)濾、蒸餾、精餾等近代分離技術(shù)。

3、第二代生物技術(shù)

以20世紀(jì)40年代出現(xiàn)的青霉素產(chǎn)品分離純化技術(shù)為代表。開(kāi)發(fā)了無(wú)菌空氣制備技術(shù)、大型好氧發(fā)酵裝置，一大批通風(fēng)發(fā)酵技術(shù)產(chǎn)品相繼投入了工業(yè)生產(chǎn)，如抗生素(如鏈霉素)、氨基酸(如谷氨酸)、有機(jī)酸(如檸檬酸)、酶制劑(如淀粉酶)、微生物多糖和單細(xì)胞蛋白等。產(chǎn)品多樣性決定了分離方法的多樣性。此階段借鑒和引進(jìn)吸收了大量近代化學(xué)工業(yè)的分離技術(shù)，如沉淀、離子交換、萃取、結(jié)晶等。

4、第三代生物技術(shù)

以20世紀(jì)70年代末崛起的DNA重組技術(shù)及細(xì)胞融合技術(shù)為代表。生物技術(shù)在其主要領(lǐng)域(如基因工程、酶工程、細(xì)胞工程和微生物發(fā)酵工程)取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，一批高附加值的產(chǎn)品(如乙肝疫苗、干擾素等)開(kāi)始面世。

20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)了一大批生理功能性物質(zhì)，如活性多糖質(zhì)、活性肽、高度不飽和脂肪酸等，生物技術(shù)在深度和廣度上都取得了很大的進(jìn)展。分離純化技術(shù)有超臨界CO2萃取技術(shù)、膜過(guò)濾技術(shù)、滲透蒸發(fā)技術(shù)、各種色譜(層析)技術(shù)等。

1、溶劑萃取法

當(dāng)生物活性物質(zhì)以不同的化學(xué)狀態(tài)(游離狀態(tài)或成鹽狀態(tài))存在時(shí)，在水及與水不互溶的溶劑中有不同的溶解度。如青霉素在酸性下成游離酸，在醋酸丁酯中溶解度較大或分配系數(shù)較大，則當(dāng)和發(fā)酵液相接觸，青霉素就從水相轉(zhuǎn)移到醋酸丁酯相中;而在中性下成鹽，在水中溶解度較大，能從醋酸丁酯轉(zhuǎn)移到水相，這樣反復(fù)萃取達(dá)到分離純化的目的。

2、離子交換分離法

利用離子交換樹(shù)脂和生物活性物質(zhì)之間的化學(xué)親和力，有選擇性地將生物活性物質(zhì)吸著上去，然后改變條件以較少量的洗脫劑將其洗脫下來(lái)，達(dá)到濃縮和提純的目的。利用此法，生物活性物質(zhì)必須是極性化合物，即在溶液中能形成離子的化合物。如抗生素為堿性，則可用酸性離子交換樹(shù)脂去提取;如抗生素為酸性，則可用堿性離子交換樹(shù)脂去分離純化。

3、吸附分離法

系利用吸附劑與生物活性物質(zhì)之間的分子引力而將生物活性物質(zhì)吸附在吸附劑上，然后再選用洗脫劑將其洗脫下來(lái)，達(dá)到分離純化的目的。

吸附劑有活性炭、白陶土、氧化鋁、各種離子交換樹(shù)脂等。其中以活性炭應(yīng)用最廣，但有很多缺點(diǎn)，如性能不穩(wěn)定、選擇性不高、可逆性差、不能連續(xù)操作、勞動(dòng)強(qiáng)度較大等，因此該法曾幾乎被淘汰，只有對(duì)新抗生素分離或其他方法都不適用時(shí)才考慮用吸附法。但1966年后，隨著一種性能優(yōu)良的新型吸附劑——大孔網(wǎng)狀聚合物吸附劑的成功應(yīng)用，吸附法又被廣泛應(yīng)用。

4、沉淀分離法

通常加入一些無(wú)機(jī)、有機(jī)離子或整個(gè)分子，能與生物活性物質(zhì)形成不溶解的鹽或復(fù)合物而自發(fā)酵液中沉淀出來(lái)。例如四環(huán)類(lèi)抗生素在堿性下能和鈣、鎂、鋇等重金屬離子或溴代十五烷基吡啶形成沉淀，青霉素可與N，N -二芐基乙二胺形成沉淀，新霉素可和強(qiáng)酸性表面活性劑形成沉淀。另外，對(duì)于兩性抗生素(如四環(huán)素)可調(diào)pH至等電點(diǎn)而沉淀，弱酸性抗生素(如新生霉素)可調(diào)pH至酸性而沉淀。

一般發(fā)酵單位越高，利用沉淀分離法越有利。因殘留在溶液中的生物活性物質(zhì)濃度是一定的，故發(fā)酵單位越高，分離純化率就越高。

5、化學(xué)萃取法

與物理萃取不同，在許多液一液萃取過(guò)程中常伴隨有化學(xué)反應(yīng)，包括相內(nèi)反應(yīng)與相界面上的反應(yīng)。這類(lèi)分離純化統(tǒng)稱(chēng)為化學(xué)萃取(反應(yīng)萃取)。

化學(xué)萃取是伴有化學(xué)反應(yīng)的傳質(zhì)過(guò)程。根據(jù)溶質(zhì)與萃取劑之間發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)機(jī)制，大致可分為五類(lèi)。即絡(luò)合反應(yīng)、陽(yáng)離子交換反應(yīng)、離子締合反應(yīng)、協(xié)同反應(yīng)、帶同萃取反應(yīng)等。

6、超臨界流體萃取法

對(duì)一般物質(zhì)，當(dāng)液相和氣相在常壓下達(dá)到平衡時(shí)，兩相的物理性質(zhì)如黏度、密度等相差很顯著，在較高壓力下，這種差別逐漸縮小，當(dāng)達(dá)到某一溫度與壓力時(shí)，兩相差別消失，合并成一相，這時(shí)稱(chēng)為臨界點(diǎn)，其溫度和壓力分別稱(chēng)為臨界溫度和臨界壓力。當(dāng)溫度與壓力略超過(guò)或靠近臨界點(diǎn)時(shí)，其性質(zhì)介于液體和氣體之間，稱(chēng)為超臨界流體。例如二氧化碳的臨界溫度為31.1℃，臨界壓力為7.3MPa。

超臨界流體的密度和液體相近，黏度和氣體相近，溶質(zhì)在其中的擴(kuò)散速度可為液體的100倍，這是超臨界流體的萃取能力和萃取速度優(yōu)于一般溶劑的原因。而且流體的密度越大，萃取能力也越大。

變化溫度和壓力可改變萃取能力，使對(duì)某物質(zhì)具有選擇性。常用二氧化碳作為萃取劑，因其臨界壓力較低，操作較安全，且無(wú)毒，適用于萃取非極性物質(zhì)，對(duì)極性物質(zhì)萃取能力差，但可加入極性輔助溶劑(稱(chēng)為夾帶劑，entrainer)來(lái)補(bǔ)救。

7、膜分離法

膜分離法(超濾法包括微濾、超濾、反滲透)是利用一定截留分子量的超濾膜進(jìn)行溶質(zhì)的分離純化。小于截留值的分子能通過(guò)膜，而大于截留值的分子不能通過(guò)膜，因而達(dá)到分離。這個(gè)過(guò)程不發(fā)生相變化，也不需加入化學(xué)試劑，消耗的能量也較少。適用于膜分離的物質(zhì)，分子量在500-1000000之間。

在小分子物質(zhì)的分離純化中，主要用于去除大分子雜質(zhì)。在大分子物質(zhì)的分離中，主要用于脫鹽、濃縮。膜分離法的主要缺點(diǎn)是濃差極化、膜的污染、壽命較短和通量低等。

分離純化是從動(dòng)植物組織、微生物培養(yǎng)產(chǎn)物或細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物中分離及純化目的產(chǎn)物的過(guò)程。系統(tǒng)地研究生物分離純化過(guò)程，能夠揭示其內(nèi)在的分離原理。利用這些原理，我們可以設(shè)計(jì)目的產(chǎn)物的分離純化方法。

由于生物活性物質(zhì)具有生理活性或藥理作用，因此在分離純化的過(guò)程中必須根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的特點(diǎn)，在保證其生物機(jī)能的前提下進(jìn)行分離純化操作。生物分離純化的特點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。

1、目的產(chǎn)物濃度低，純化難度大

原料液中目的產(chǎn)物的濃度一般都很低，有時(shí)甚至是極微量的，如胰腺中脫氧核糖核酸酶的含量為0.04%、胰島素含量為0.002%，膽紅素在膽汁中含量為0.05%～0.08%，但雜質(zhì)的含量卻相對(duì)較高，這樣就有必要對(duì)原料液進(jìn)行高度濃縮。

2、活性物質(zhì)性質(zhì)不穩(wěn)定，操作過(guò)程容易失活

生物活性物質(zhì)的生理活性大多是在生物體內(nèi)的溫和條件下維持并發(fā)揮作用的，目的產(chǎn)物大多數(shù)對(duì)熱、酸、堿、重金屬、pH值以及多種理化因素都比較敏感，容易失活。外部條件不穩(wěn)定或急劇發(fā)生變化，容易引起生物活性的降低或喪失。因此，為維持生物活性物質(zhì)的活性，分離純化過(guò)程的操作條件都有嚴(yán)格的限制。

3、生物材料中的生化組分?jǐn)?shù)量大，分離困難

原料液中雜質(zhì)成分多，甚至目的產(chǎn)物與雜質(zhì)的理化性質(zhì)如溶解度、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等往往比較相近，所以分離純化比較困難。

4、生物材料容易變質(zhì)，保存困難

生物材料容易腐敗、染菌、被微生物的活動(dòng)所分解或被自身的酶所破壞，甚至機(jī)械攪拌、金屬器械、空氣、日光等對(duì)生物活性物質(zhì)的活性都會(huì)產(chǎn)生影響。因此，生物分離純化方法的正確選擇，對(duì)維持目的產(chǎn)物的穩(wěn)定性起著至關(guān)重要的作用。

5、生物產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)高

生物產(chǎn)品一般用作醫(yī)藥、食品和化妝品，與人類(lèi)生命息息相關(guān)。因此，要求分離純化過(guò)程必須除去原料液中的熱原及具有免疫原性的異體蛋白等有害人體健康的物質(zhì).并且防止這些物質(zhì)在操作過(guò)程中從外界混入。

由于工業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)品眾多，原料廣泛，性質(zhì)多樣，用途各異，且對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量與純度的要求也可以是多方面的，因而其分離純化技術(shù)、生產(chǎn)工藝及相關(guān)裝備也是多種多樣的。大多數(shù)生物產(chǎn)品的分離純化過(guò)程按生產(chǎn)過(guò)程的順序大致可分為四個(gè)類(lèi)似步驟，即預(yù)處理與固液分離、提取(初步純化)、精制(高度純化)和成品制作，具體流程見(jiàn)下圖。

1、預(yù)處理與固液分離

在這一步驟中，過(guò)濾和離心是基本的單元操作。為了加速兩相分離，可采用凝聚和絮凝等預(yù)處理技術(shù);為了減少過(guò)濾介質(zhì)的阻力，可采用錯(cuò)流膜過(guò)濾技術(shù)。但這一步對(duì)產(chǎn)物濃縮和產(chǎn)物質(zhì)量的改善作用很小。如果是胞內(nèi)產(chǎn)物還要進(jìn)行細(xì)胞破碎及碎片分離純化。

2、提取(初步純化)

這一步驟主要目的是除去與目標(biāo)產(chǎn)物性質(zhì)差異較大的雜質(zhì)，通常目標(biāo)產(chǎn)物要求有較大濃縮比，可選技術(shù)也比較多。典型的分離純化方法有吸附、萃取等。

3、精制(高度純化)

這一步驟主要目的是除去與產(chǎn)物的物理化學(xué)性質(zhì)比較接近的雜質(zhì)，所選技術(shù)要求對(duì)產(chǎn)物有高度選擇性。典型的分離純化方法有層析、電泳等。結(jié)晶特別是重結(jié)晶通常也能獲得高純度的產(chǎn)物。

4、成品制作

成品形式多種多樣，有液態(tài)也有固態(tài)，美觀的產(chǎn)品形態(tài)也是產(chǎn)品檔次的一個(gè)標(biāo)志。產(chǎn)物的最終用途決定了產(chǎn)品的形式及最終的加工方法。濃縮和結(jié)晶是常用的方法，大多數(shù)產(chǎn)品還必須經(jīng)過(guò)干燥。