血紅蛋白（Hb）變異，是一組由珠蛋白基因突變引起的常見遺傳性變異，其特征是血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。迄今為止，已鑒定出1300多個(gè)變異體，其中，超過150個(gè)不穩(wěn)定的Hb變異體被記錄為引起不同嚴(yán)重程度的溶血性貧血的原因。對(duì)Hb變異體進(jìn)一步的研究，可用于新生兒篩查、產(chǎn)前篩查̷̷此外，許多研究表明Hb變異可能會(huì)對(duì)糖化血紅蛋白（HbA1c）的測(cè)量產(chǎn)生干擾，因此，臨床相關(guān)Hb變異體的鑒定和表征對(duì)于做出正確診斷至關(guān)重要。目前，高效液相色譜法（HPLC）和毛細(xì)管電泳（CE）是HbA1c測(cè)量和Hb分析的一線方法。

近日，北京大學(xué)深圳醫(yī)院檢驗(yàn)科紀(jì)玲博士團(tuán)隊(duì)使用融智生物科技（青島）有限公司的QuanTOF發(fā)現(xiàn)了一種新的Hb變種，即Hb遼寧，這是國(guó)內(nèi)首次由MALDI-TOF MS鑒定出來的血紅蛋白變異體。相關(guān)研究結(jié)果已經(jīng)發(fā)表在Clin Chem Lab Med 2019上，論文題為“Detection of a novel hemoglobin variant Hb Liaoning by matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry”（https://doi.org/10.1515/cclm-2019-0300）。

先證者是來自中國(guó)遼寧省的一名36歲漢族男子，被送往北京大學(xué)深圳醫(yī)院進(jìn)行例行健康檢查。首先使用毛細(xì)管電泳（CE）分析儀測(cè)量HbA1c水平，該分析儀沒有產(chǎn)生HbA1c值，非典型電生理圖顯示無明顯異常峰值。電泳軟件將配置文件識(shí)別為“非典型”，主要是由于存在額外的峰值。因此，研究人員假設(shè)Hb變異可能會(huì)干擾HbA1c分析。隨后，使用高效液相色譜法（HPLC）、硼酸親和力高效液相色譜法、免疫分析法和MALDI-TOF分析儀分別進(jìn)一步定量HbA1c。其中，MALDI-TOF分析儀為融智生物科技（青島）有限公司的新一代寬譜定量飛行時(shí)間質(zhì)譜QuanTOF。

融智生物新一代寬譜定量飛行時(shí)間質(zhì)譜平臺(tái)QuanTOF

HbA1c測(cè)試結(jié)果分別為：5.2％（33mmol/mol，高效液相色譜法），5.1％（32mmol/mol， 硼酸親和力高效液相色譜法），4.9％（30mmol/ mol，免疫分析法）和4.9％（30mmol/mol， QuanTOF）。與從硼酸親和力高效液相色譜法獲得的結(jié)果比較，觀察到高效液相色譜法（2.0％），免疫分析法（-3.9％）和QuanTOF（-3.9％）的可接受偏差（國(guó)家糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)劃[NGSP]標(biāo)準(zhǔn)，偏差在 5.0％內(nèi)）。高效液相色譜法的色譜圖未顯示變異體。然而，QuanTOF的質(zhì)譜圖顯示出異常的Hb鏈（m/z=15,169.4），相對(duì)強(qiáng)度占總 Hb的26.0％（圖1B）。在譜圖中還發(fā)現(xiàn)了正常的Hb鏈，包括 Hb亞基（m/z=15,127.9）， Hb亞基（m/z = 15,868.0）和糖化- Hb（m/z=16,030.0）（圖1A，B）。

對(duì)照血紅蛋白和Hb遼寧的MALDI-TOF質(zhì)譜。

（A）來自正常成人的對(duì)照血紅蛋白和（B）來自先證者的Hb遼寧。分開的兩個(gè)峰質(zhì)量相差41.5Da，清楚地表明存在變異體 鏈（m/z=15,169.4）。箭頭表示存在正常 鏈（m/z=15,127.9），正常 鏈（m/z=15,868.0）和糖化- Hb（m/z=16,030.0）。

使用毛細(xì)管電泳（CE）和離子交換高效液相色譜進(jìn)行隨后的Hb分析。令人驚訝的是，沒有出現(xiàn)異常峰或非典型色譜圖的跡象。研究人員隨后進(jìn)行Sanger測(cè)序以確認(rèn)Hb變異體的存在以及性質(zhì)。測(cè)序數(shù)據(jù)顯示 2基因中存在新的雜合突變[ 15（A13）（GGT> GTT），Gly> Val，HBA2：c.47 G> T]，導(dǎo)致甘氨酸的編碼轉(zhuǎn)換（分子量：75.1 Da）在密碼子15處的纈氨酸（分子量：117.1Da）。如圖1B所示，從甘氨酸到纈氨酸（42.0Da）的取代誘導(dǎo)的相對(duì)分子量的變化也可以從 Hb亞基和變異體Hb亞基（41.5Da）之間的m/z變化中找到。由于以前沒有報(bào)道該變種，研究人員根據(jù)患者所在的地區(qū)將其命名為Hb遼寧。

Sanger測(cè)序的結(jié)果。 Sanger測(cè)序揭示了一種新的突變[ 15(A13)(GGT>GTT), Gly>Val, HBA2:c.47 G>T]。

為了確定患者與Hb遼寧相關(guān)的血液學(xué)特征，對(duì)其進(jìn)行血液學(xué)數(shù)據(jù)測(cè)量顯示，得到的血液學(xué)指標(biāo)并沒有發(fā)現(xiàn)貧血跡象，這表明患者非病理性Hb變異。

Hb變異是溶血性貧血的原因之一，同時(shí)也是HbA1c測(cè)量中的分析干擾。在本研究的案例中，Hb遼寧沒有顯示出明顯的臨床表現(xiàn)。然而，該變異體在使用CE法的HbA1c測(cè)量中引起干擾。在以前的研究中，通常使用硼酸鹽親和HPLC方法作為比較方法，因?yàn)樗鼰o論Hb種類如何都測(cè)量總糖化血紅蛋白，因而被認(rèn)為不受大多數(shù)Hb變異體的影響。結(jié)果中提到的可接受的偏差表明Hb遼寧對(duì)高效液相色譜和QuanTOF的HbA1c測(cè)量沒有顯著影響。

高效液相色譜法（HPLC）和毛細(xì)管電泳（CE）是HbA1c測(cè)量和Hb分析的一線方法。僅有有限的研究顯示了MALDI-TOF MS在HbA1c測(cè)量中的應(yīng)用。在目前的研究中，陽離子交換HPLC和電泳方法在檢測(cè)Hb遼寧時(shí)面臨挑戰(zhàn)，因?yàn)殡姾刹町惒幻黠@且超出檢測(cè)限。而MALDI-TOF MS能夠通過m/z差異區(qū)分Hb遼寧。當(dāng)然了，MALDI-TOF MS可能無法區(qū)分所有類型的Hb變異體，尤其是當(dāng)m/z差異很小且超出儀器分辨率時(shí)。最后同樣重要的是，鑒定Hb變異和識(shí)別HbA1c檢測(cè)中的干擾是至關(guān)重要的，尤其是在Hb變異的高患病率區(qū)域。